Elaboración de Maqueta: Biocombustible de cuarta generación.

2. Biocombustible de cuarta generación El progresivo agotamiento de las reservas de combustibles fósiles está promoviendo la búsqueda de fuentes alternativas renovables, donde el biodiesel se presenta como una de las alternativas para cubrir esa demanda; pero su alto costo de producción, plantea otro grave problema, por lo que los investigadores se propusieron un reto en conseguir métodos de rutina para transformar genéticamente microalgas industrialmente prometedoras. La presente maqueta es basada en el paper “Microalgas para biodiesel: desarrollo de un método de transformación genética para Scenedemus almeriensis, una especie con potencial industrial” que tiene como autores a: YasmeenDautor, Tarik Chileh, Patricia Úbeda Mínguez, Aurora Mañas Fernández, Federico García Maroto y Diego López Alonso. Ilustración 1. Paper sobre un método de transformación genética para la producción de biodiesel.

3. Scenedesmus almeriensis La investigación plantea a Scenedesmus almeriensis, que es una especie de alga verde de agua dulce, procedente de charcos de desecación de invernaderos; la cual fue aislada por el grupo del Dr. Molina Grima del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería. Entre las ventajas de esta especie tenemos su elevada productividad de aceite, capaz de producir anualmente unos 20.000 L/ha, superando la especie vegetal más productiva en aceite que es la palma; otra de sus ventajas es que no demanda agua de riego, por lo que pueden crecer en aguas no útiles para la agricultura, en aguas residuales, hasta en agua de mar. Una vez que el césped verde de microalgas es bien patente, a cada placa de éstas se le añade una cierta cantidad del cultivo de Agrobacterium tumefaciens y se mezcla todo bien, a fin de propiciar el contacto entre las células de Scenedesmus almeriensis y las de Agrobacterium tumefaciens, se dejan de este modo en co-cultivo durante cierto periodo de tiempo. Ilustración 1. Elaboración de Scenedesmus almeriensis.

4. Cultivo en TAP líquido El proceso de transformación genética comenzó con el cultivo en TAP (Tris-acetato-fosfato) en líquido, que es un medio de rutina para algas verdes de agua dulce; se procedió a la siembra de Scenedesmus almeriensis en una serie de placas, estas se cultivan en un medio comercial denominado agar nutritivo a Ph 8, con un fotoperiodo de 18 horas de luz y 6 de oscuridad, a una temperatura de 26°, teniendo como resultado una especie de césped de microalgas. Ilustración 2. Elaboración de Cultivo en TAP líquido. • Aparte, con la antelación suficiente, se cultiva el Agrobacterium tumefaciens para tenerlo listo en el momento en que sea necesario. Ilustración 3. Esquema del proceso de transformación genética.

5. Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Ilustración 4. Organización del T-DNA del vector Pcamba 1305.1. En este proceso se genera la transformación genética, que es llevado a cabo mediante la Agrobacterium tumefaciens LBA4404, esta es una bacteria especializada en infectar células vegetales, mediante el vector de transformación plásmido Pcambia 1305.1, el cual se representa por los dos genes que contiene, uno es el “hpt” (que es un gen que genera resistencia a la higromicina) y el gen GUS como reportero (que codifica una proteína enzimática que puede dar una reacción coloreada), cada uno de Ilustración 5. Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 • ellos están flanqueados por sus respectivos promotores (35S) y señales de terminación (poly-A); en medio queda el sitio de clonación múltiple (MCS) y en los extremos los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) que delimitan el T-DNA, todo este segmento es transferido a la microalga.

6. Colonias transgénicas de S. almeriensis Transcurrido este periodo, fueron cosechadas las células con medio líquido TAP conteniendo cefotaxima, que es un antibiótico que mata a Agrobacterium pero no afecta a Scenedesmus. Finalmente, se sembraron las células cosechadas en placas con medio selectivo conteniendo higromicina y se dejó crecer hasta que se vieron a simple vista colonias verdes. Ilustración 6. Colonias transgénicas de S.almeriensis. La determinación de las concentraciones óptimas de antibióticos para el método de transformación genética se hizo mediante un experimento factorial de 6x4 en el que se ensayaron las siguientes concentraciones: higromicina 0,10, 20, 30, 40 y 50 mg/L; cefotaxima 0, 250, 500, y 750 mg/L. Como resultado de esta investigación se obtuvo alrededor de 700 clones transgénicos de Scenedesmus almeriensis en una sola ronda de transformación genética, por lo tanto, se puede concluir que se ha desarrollado un procedimiento de transformación genética eficiente para la microalga Scenedesmus almeriensis.

7. Fotobioreactor tubular Quiero contarles que esta especie ya ha sido cultivada, ubicándose en las instalaciones de “Las Palmerillas” (Fundación CAJAMAR) situadas en La Mojonera (Almería) en reactores de 6.000 L, comprobando así que reúne todos los requisitos para poder convertirse en un microorganismo industrial, teniendo como producto final el biodiesel. Ilustración 7. Fotobioreactor tubular.