1 / 36

Metodická základna molekulární patologie

Metodická základna molekulární patologie. Michala Fiurášková, Jan Bouchal, Zdeněk Kolář. Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc http://lmp.upol.cz http://ustavpatologie.upol.cz. Molekulární metody. genová úroveň nemoci přesné stanovení diagnózy infekční choroby

abel
Download Presentation

Metodická základna molekulární patologie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metodická základna molekulární patologie Michala Fiurášková, Jan Bouchal, Zdeněk Kolář Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc http://lmp.upol.czhttp://ustavpatologie.upol.cz

  2. Molekulární metody • genová úroveň nemoci • přesné stanovení diagnózy • infekční choroby • onkologická onemocnění • určeníproliferační aktivity (imunohistochemické stanovení Ki67, PCNA) • predispozice k chorobám-ateroskleróza, diabetes • stanovení otcovství • stanovení DNA ploidie - počítačová analýza, průtoková cytometrie) • stanovení diferenciačních markerů (CD), onkoproteinů, onkofetálních antigenů (imunohistochemie, průtoková cytometrie) • stanovení exprese receptorů pro růstové faktory (imunohistochemické: steroidní hormony, c-erbB-2…) • somatické a germinální mutace

  3. ÚVOD

  4. Molekulární diagnostika Zásadní roli hrají: • Monoklonální protilátky • Hybridizace • PCR (polymerázová řetězová reakce)

  5. Monoklonální protilátky • Imunohistochemie (téměř 200 protilátek na Ústavu patologie) • Analýza proteinů v buněčných lyzátech (imunoblotting) • ELISA test

  6. Imunohistochemie aplikace imunologických metod při studiu tkání nebo buněk afinita antigenu a specifické protilátky

  7. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) • „sandwich“ protilátka-antigen • Kvantitativní analýza exprese proteinů • Těhotenské testy • Detekce infekčních agens

  8. Western analýza=imunoblotting (proteiny) kDa 220 97 66 45 30 20 nitrocelulózová membrána elektroforéza (polyakrylamidový gel) prim, sek. protilátka chemiluminiscence p53 bandy Bcl-XL

  9. Southern-Northern blotting (DNA, RNA) • rozštěpení NK – restrikční endonukleáza • elektroforéza • detekce specifického • fragmentu kapilárním přenosem a hybridizací

  10. Metody založené na hybridizaci arteficiální spojení dvou vláken DNA komplementarita bází, DNA sonda (próba) • ISH (in situ hybridizace) • FISH (fluorescenční ISH) • SKY (spektrální karyotypování) • mFISH (multi color FISH) • CGH – komparativní genomová hybridizace • DNA čipy

  11. FISHfluorescenční in situ hybridizace • Možnost analýzy interfázních chromozomů (nevyžaduje kultivaci buněk a přípravu metafázických chromozomů) • - Detekce polysomií, translokací, inverzí, delecí

  12. SKY – spektrální karyotypování(spectral karyotyping) • - počítačové zobrazení a analýza • cytogenetické laboratoře • identifikace početních i strukturálních chromozomálních aberací

  13. mFISH Multi color FISH/ high resolution banding kombinace fluorochromů

  14. CGH – komparativní genomová hybridizace(Comparative Genomic Hybridization) • vizualizace chromozomových poruch hybridizace

  15. DNA čipy (microarray) • izolace DNA • hybridizace • počítačové zpracování Alterace DNA změněná exprese a aktivita proteinů DNA sekvence (array)

  16. DNA čipy

  17. DNA čipy • - identifikace nových genů • unikátní informace o změnách • v expresi celého genomu v odpovědi na pokusný zásah • nové diagnostické markery • (BRCA1, BRCA2-adenokarcinom mléčné žlázy nebo ovaria)

  18. PCR – polymerázová řetězová reakce(polymerase chain reaction) detekce abnormální funkce genu (onkogeny, viry, bakterie, paraziti) enzymatická syntéza a amplifikace specifických sekvencí NK primer

  19. Využití PCR- detekce libovolných mutací- identifikace virů, bakterií, buněčných parazitů- RT-PCR (reverzní transkriptáza) –pro detekci mRNA

  20. 3SR amplifikační reakce(self-sustained sequence replication) • metoda detekující genové amplifikace • využívá kolektivního účinku reverzní transkriptázy (např. z ptačího myeloblastového viru), RNázy H • (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerázy. • přírodní replikační proces retrovirů realizovaný in vitro.

  21. Přehled 1 • Diagnostika • Monoklonální protilátky (IHCH, elisa, imunoblotting) • Hybridizace (FISH, CGH, DNA čipy) • PCR • detekční koncovka (fluorescenční, radioaktivní, barevná) • Základní výzkum • Terapie

  22. Základní výzkum • Snaha o pochopení životních pochodů a možnosti jejich ovlivnění • Může vycházet z dat získaných při klinické práci • Buněčné kultury • ovlivňování chemickými látkami • cílené zásahy do vnitřního prostředí buněk (antisense RNA, transientní nebo stabilní transfekce = zavádění cizích genů do buněk) • studium proliferace, apoptózy, jednotlivých i globálních změn exprese genů (DNA čipy, WB, IHCH)

  23. Základní výzkum • In vivo na zvířatech (výsadní postavení myší) • athymické nahé myši pro studium nádorů • knock-out/in myši (inaktivace/nový gen transgenní organismy) • Průtoková cytometrie • Tkáňová mikroarray • Mikrodisekce • mechanická • laserová

  24. Průtoková cytometrie • technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi • cíleně separovat částice (buňky) splňující požadované parametry • běžně užívané aplikace: • detekce apoptózy • analýza buněčného cyklu • mnohobarevná imunofenotypizace • buněčná proliferace

  25. Tkáňovámicroarray (TMA) 1 parafinový blok – soubor různých tkání 0.06cm 0.2cm

  26. Lung MB H&E Imunohistochemické barvení TMA MNF-116 (total keratin) barvení

  27. Mechanická mikrodisekce separace buněk z tkáně

  28. Laserová mikrodisekce (LCM)

  29. Restrikční endonukleázy enzymy– vyštěpení určitých úseků DNA • Molekulární klonování (plasmidy = extrachromozomální kruhové molekuly DNA • - DNA knihovna (soubor sekvencí lidské DNA, DNA inzert) - cDNA knihovna (přepis mRNA) • Sekvenování - lineární sekvence nukleotidů

  30. Projekt HUGO (Human Genome Mapping Organization) • složení lidského genomu • 30-40 tisíc genů (jen 2x více než háďátko nebo octomilka) • pouze 3-5% celého genomu jsou sekvence překládané do proteinů • 95% genomu představují repetice-nekódující sekvence

  31. Přehled 2 • Diagnostika • Monoklonální protilátky • Hybridizace • PCR • Základní výzkum • Buněčné kultury + DNA manipulace • Zvířecí modely • Tkáňová mikroarray • mikrodisekce • Terapie

  32. Terapie • Získání léku na základě poznání biologického procesu, na základě screeningu chemických knihoven • Klinické testy • Genová terapie

  33. Amplifikace HER2-NEU u nádorů prsu Imunohistochemické vyšetření + FISH Her2 = receptor z rodiny epidermálních růstových faktorů, gen amplifikován u 25-30% karcinomu mléčné žlázy Indikace léčby„herceptinem“ (blokace receptoru) Vyšetření 6 tis. x roční léčba 1 mil Kč (červeně HER2, modře centromera 17, zeleně TOPO2a)

  34. Genová Terapie • -Přenos genetického materiálu, jenž má léčebný účinek • -Cílené vyřazení aberantního proteinu (např.onkogenu u rakoviny) • Obnova exprese mutovaného genu u dědičných chorob • Problém obranných mechanismů buňky k cizorodé DNA • Problém selektivní terapie defektních buněk

  35. Genová Terapie („antisense“ technologie) Antisense RNA – RNAkomplementární k určité mRNA komplex translace umlčení genu

  36. Shrnutí • Diagnostika • Monoklonální protilátky • Hybridizace • PCR • Základní výzkum • Buněčné kultury + DNA manipulace • Zvířecí modely • Tkáňová mikroarray • mikrodisekce • Terapie • snaha o zacílení na molekulární úrovni

More Related