1 / 34

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF. Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW. Warszawa, 16.04.2012. Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas. Podstawowe definicje. Najczęściej stosowane skróty.

aviva
Download Presentation

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW Warszawa, 16.04.2012

  2. Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas

  3. Podstawowe definicje

  4. Najczęściej stosowane skróty EI (ElectronImpact) - jonizacja elektronamiMALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycąESI (ElectrosprayIonization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznymHPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowaTOF  (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotuPSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonówm/z - stosunek wartości masy do liczby ładunkówDIOS (Desorption/Ionization on PorousSilicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemieICP  (InductivelyCoupledPlasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie

  5. Idea działania spektrometru mas • źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji, • analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku. • detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.

  6. Jonizacja próbki

  7. Jonizacja próbki cd.

  8. Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI Nitrogen laser: pro: well structured energy profile contra: slow (maximum 50Hz) Nd:YAG laser: pro: fast (up to 1000Hz) contra: Gaussian energy profile (non-structured) Smartbeam/Smartbeam II (modified Nd:YAG laser): pro: fast (up to 1000Hz) pro: well structured energy profile A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)

  9. Matryce Procesy zachodzące pod wpływem impulsu laserowego Absorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy. Odparowanie próbki na głębokość 2-3 li wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni. Dysocjacja termiczna matrycy. Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+). Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe drogi: - dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion - oderwanie elektronu - oderwanie bądź przyłączenie protonu - przyłączenie kationu bądź anionu

  10. Matryce • Pożądanymi cechami matrycy MALDI są: • dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania próbki; • rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem; • kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu; • obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych; • stabilność w warunkach wysokiej próżni; • wspomaganie jonizacji analitu; • zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).

  11. Matryce Sinapicacid Kwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy SINA proteiny Gentisicacid Kwas 2-5-dihroksy benzoesowy DHB peptydy 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoicacid Kwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy HABA Peptydy, polimery Dithranol 1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on DIT polimery α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Kwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy CHCA, α-CHCA Peptydy, lipidy 2,4,6-Trihydroxyacetophenone 2,4,6-trihroksy acetofenon THAP oligonukleotydy

  12. Tryb liniowy

  13. Tryb liniowy • Jak zwiększyć rozdzielczość? • Pulsedionextraction – polepszenie ogniskowania jonów • Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja • Użycie reflektronu

  14. Optymalne przygotowanie próbki

  15. Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to: Metoda wysychającej kropli (drieddropletmethod) – jednowarstwowa:Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe – w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę (0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli kationizującej.Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i powtarzalność oraz intensywność sygnałów. Metoda cienkiej warstwy (thin-layermethod) – dwuwarstwowa:Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy. Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospraysampledepositon). Metoda mieszania ciał stałych (solid/solidsamplepreparation):Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych

  16. Epot = zeUEkin = 1/2mv2 zeU = 1/2mv2v = (2zeU/m)1/2 t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2

  17. Tryb reflektronu

  18. Tryb reflektronu

  19. Profil izotopowy

  20. Profil izotopowy C41H69N13O14S [M+H]+: 1000.4880 [M+H]+: 1001.1409 C112H164N29O34S2 [M+H]+: 2524.1510 [M+H]+: 2525.8196 C253H363N55O75S [M+H]+: 5404.6075 [M+H]+: 5407.9984 Masa monoizotopowa Masa średnia

  21. Kalibracja tof= tdelay+ tacc + tdrift F = E q = M a d = a/2 tacc2 E = U/d q = z e tacc = d √(2m/Uze) tdrift= L √(m/2zeU) tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU) tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z) t = C0+C1√(m/z)

  22. MALDI–ToF/ToF Ionpath in TOF1 region (linear TOF) Ionpath in TOF2 region (reflectorTOF) Ion source1 = MALDI ionsource Ion source2 = LIFT re-accelerationcell PCIS = Timediongate PLMS = Post LIFT meta stablesuppressor

  23. MALDI–ToF/ToF

  24. MALDI–ToFw badaniach polimerów • Za pomocą MALDI można wyznaczyć następujące parametry polimerów: • Mn, Mw, PD • grupy końcowe polimeru • budowę kopolimeru Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447

  25. C B A A9B2C A10B2C A8B2C A9BC A9B3C A10BC A8B3C A11BC A7B3C A8B4C A7B4C A6B4C A10C A11C A11C

  26. Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin  Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren)  Polisacharydy, teflon, poliolefiny mass discriminationeffect

  27. MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylenechloride, THF, and chloroform Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.

  28. Wskazówkidla PT Klientów • Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7Torr). • Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę próbki), lub w większych pojemnikach. • W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol, polimeru 50 - 200 pmol. • Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !) • Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku. Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych. • Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np. HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd. • Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności nie powinna zawierać: • nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców, • detergentów !!!, • buforów, zwłaszcza fosforanowych, • substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą), • W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje. • Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000 • Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi)

  29. Polecana literatura • M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; AnalyticalChemistry, 57, 2935-2939 (1985) • K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida; RapidCommunications in Mass Spectrometry, 2, 151-153 (1988) • R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; RapidCommunications in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989) • M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journalof Mass Spectrometry, 35, 1-12, (2000) • R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass SpectrometryReviews, 17, 337-366 (1998) • G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ MassSpectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P.Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.

  30. Dziękuję za uwagę…

More Related