Aula de enzimologia Tema Efeito da temperatura e pH na atividade e estabilidade das enzimas

1. Aula de enzimologia Tema Efeito da temperatura e pH na atividade e estabilidade das enzimas Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br

2. Conteúdo: • Determinação da temperatura ótima • Energia de ativação • Estabilidade térmica • Parâmetros termodinâmicos • 4.1 Enzimas termoestáveis • 4.2 Enzimas adaptadas ao frio • Influência do pH • Termoestabilidade x termofilicidate

3. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA AÇÃO ENZIMÁTICA 3  temperatura dois efeitos ocorrem: • a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; • a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. temperatura ótima - é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade constante por um período de tempo.

4. Atividade Enzimática É dada pela medição da velocidade inicial da reação sob uma faixa de condições determinadas

5. O aumento na temperatura aumenta o numero de colisões Energia de ativação (Ea) – energia mínima para que uma reação ocorra A + B  C + D

6. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA • Ea  Lei de Arrhenius • Ea pode ser determinada medindo-se a constante de velocidade da reação em ≠ temperaturas. • Curva A: gráfico usual. • Curva B: o gráfico mostra uma variação definida na inclinação, se em determinada temperatura, uma etapa ≠ se torna limitante da velocidade. • Curva C: uma queda brusca na curva indica inativação enzimática.

7. Determinação dos parâmetros termodinâmicos A + B  C + D equilíbrio velocidade Keq relaciona-se com ∆G v relaciona-se com Eact K – cte Boltzman (1,38×10−23 J. K−1) h – cte Planck (6,626×10−34 J/s)

8. Determinação dos parâmetros termodinâmicos ∆G = ∆ H - T ∆ S -RT ln K eq = ∆ H - T ∆ S ln Keq = – ∆H 1 + ∆ S R T R ln Kcat.h= – ∆H 1 + ∆ S Kb. T R T R Kcat = Keq.A Keq = kcat/( Kb.T) h Kb – cte Boltzman (1,38×10−23 J. K−1) h – cte Planck (6,626×10−34 J/s)

9. ∆ S R – ∆H R ∆S ∆H

10. Determinação da Energia de Ativação de uma endoglucanase Dados obtidos em temperaturas entre 25 e 70 oC Ea = 3,32 kJ/mol A temperatura ótima foi a 55oC Ea= 96,7 kJ/mol Plot trifásico(CMC tem 2 conformações até a temp ótima)

12. Menor entalpia do transgênico indica que ele é altamente ativo e eficiente

13. Estabilidade enzimática Capacidade das enzimas de reter sua capacidade catalítica sob diferentes condições de reação ao longo do tempo – função biológica das enzimas e está intimamente associada à sua estrutura tridimensional Desnaturado nativo

14. Termoinativação Ta (oC) t1/2 (min) 47 138,6 53 9,77 56 2,3 Determinação da energia de desativação Ead = 378 kJ/mol

15. Texto para leitura: M. R. Javed, M. H. Rashid, H. Nadeem, M. Riaz & R. Perveen - Catalytic and thermodynamic characterization of endoglucanase (CMCase) from Aspergillus oryzae cmc-1 Appl Biochem Biotechnol (2009) 157:483–497

16. Enzimas adaptadas ao frio Em temperaturas baixas a energia cinética do sistema é insuficiente para superar a barreira de reação Como as enzimas evitam um decréscimo na sua atividade como consequência de uma queda na temperatura de 37 para 0o C? ln Kcat.h= – ∆H 1 + ∆ S Kb. T R T R Kcat resultado do decréscimo no ∆ H (menor numero de interações que necessitam ser quebradas durante a formação do estado de transição).

17. % atividade enzimática máxima INFLUÊNCIA DO pH V pH • Ionização de grupos em E e/ ou S. • A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH ótimo. • Efeito de tampões e força iônica.

18. INFLUÊNCIA DO pH inativa ativa inativa EH22+ EH+ + H+  E + 2H+ pKa = 6,0 pKa = 9,0 Em pH desaparecimento das cargas negativas (grupos COOH de Asp e Glu) Em pH desaparecimento das cargas positivas (acúmulo de cargas negativas em grupos COOH e nas tirosinas e cisteínas)

19. Efeito do pH na V Determinação gráfica dos valores de pKs

20. Log Vmax x pH = Vmax e pKes1 e pK es2 Log pKs x pH = km Log vmax/ks = pke1 e pke2

22. pKe1= 4 pKe2 = 8

23. kM

24. pKes1 = 5,1 pKes2 = 8,5

25. pH ótimo de uma endoglucanase pH ótimo – 4,1 a 5,3 - , com atividade máxima no pH 4,4 pKes1 pKes2 Os valores de pKes1 = 3,5 e pKes2 = 6,4 indicam a presença de Asp e Glu como doadores de prótons e His como aceptor.

26. Estabilidade ao pH

27. Considerações finais: • A estrutura tridimensional da enzima pode ser afetada por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais. Isto torna a atividade enzimática dependente do pH e da temperatura. • Características termodinâmicas das enzimas são importantes para identificar a ocorrência de estados conformacionais distintos. • Através da determinação da temperatura ótima e da termoestabilidade da enzima é possivel determinar seus parâmetros termodinamicos. • Através de medidas da velocidade da reação em função do pH é possíivel especular sobre os grupos envolvidos na catálise.