Deteksi biofouling dalam Sistem Air Minum

1. Deteksi biofouling dalamSistem Air Minum

2. ANALISIS MIKROSKOP ELEKTRON PEMINDAI (SEM) Mayoritas studi awal karakteristik biofilm  SEM (Scanning Electronic Microscope) . Untuk mempelajari isi dan sifat matriks: • pengukuran ketebalan (cara lain: mikroskop cahaya) karena resolusi dan pembesaran yang lebih baik serta gambar 3-D • menentukan tingkat dan sifat biofilm pada permukaan pipa (hubungan antara bakteri dan mikroorganisme lainnya dengan materi partikulat dan terutama dengan permukaan bagian dalam pada pipa-pipa air). • informasi mengenai keberadaan dan keragaman bakteri dan virus dalam fase planktonik • menentukan morfologi dan distribusi dari mikroorganisme pada permukaan air dan mikroanalisis sebaran energi X-ray digunakan • menentukan komposisi kimia pada permukaan pipa. • komposisi permukaan lekatan (attachment) dapat menentukan anggota populasi mikrobiologi

3. ANALISIS MIKROSKOP ELEKTRON PEMINDAI • Kelemahan SEM: • Penyusunan sampel: • Sampel bersifat tetap dalam larutan gluteraldehida, yang telah dicuci dan didehidrasi untuk meningkatkan konsentrasi etanol, yang telah dikeringkan dan dipasang pada aluminium rintisan. • Sampel ini kemudian diolah untuk menghasilkan kontras, biasanya dilapisi dengan emas, • Dua pilihan dalam pengeringan alternatif: Pengeringan titik kritis & Pengeringan beku (pengeringan beku lebih menguntungkan daripada pengeringan titik kritis) • Distorsi yang dialami oleh biofilm selama tahap dehidrasi  ESEM untuk observasi langsung terhadap preparasi basah biofilm (namun masih ESEM masih sedikit) • Secara keseluruhan, SEM atau Environmental SEM (ESEM) lebih baik daripada mikroskop cahaya konvensional meskipun ada kelemahan dari penysunan sampel ini, karena lebih rinci dan lebih mendalam tentang biofilm.

4. PERANGKAT ROBBINS • Informasi in situ biofilm  perangkat 'Robbins‘, terdiri dari: • silinder, yang biasanya terbuat dari stainless steel dengan lubang ulir di sampingnya. • Sekrup stainless steel dengan slide kaca atau slide Polietilen dimasukkan melalui lubang-lubang pada dinding-samping. • Perangkat yang telah dirakit dapat dipasang pada sistem distribusi dan slide yang telah tersusun dapat dipindahkan secara independen pada berbagai waktu. Setiap biofilm yang ada kemudian dapat diperiksa menggunakan teknik yang tepat.

5. The classic: Robbins Device Permukaan yg dapat dipindahkan • Pindahkan permukaan uji setelah waktu tertentu • Pengamatan di laboratorium  Kerugian: Terputus-putus, waktu yang lama sampai hasil yang diperoleh • "Asli" ​​perangkat Robbins: dirancang untuk mengekspos menguji permukaan berdekatan dengan dinding pipa internal untuk mensimulasikan kondisi hidrodinamika yang sama

6. PERSIAPAN ANALISIS BIOFILM • Tahapan: • Mengikis biofilm dari permukaan, • Menghomogenkan sampel • Memeriksa sub-sampel menggunakan teknik pembiakan • Alat untuk mengikis: • pemeriksaan gigi steril, • pengikis sel steril atau • Atau implementasi steril yang cocok lainnya • sonikasi langsung + sonikasi lanjut untuk menghomogenkan sampel • sampling vakum (untuk drum PVC) dengan cara biofilm disedot keluar menggunakan penyangga fosfat sebelum dihomogenkan dan dianalisis dengan menggunakan teknik spread plate pada agar-agar R2A(Teknik belum dimanfaatkan luas, efektivitasnya belum diketahui). • Kelemahan pengikisan: • potensi sel hilang atau rusak • makan waktu • tidak mampu memberikan representasi lokasi dan status in situ dari seluruh biofilm. • Namun, banyak informasi mengenai biofilm yang saat ini tersedia telah diperoleh memakai teknik pengikisan ini diikuti dengan analisis lanjut. R2A agaradalah suatu medium kultur yang dikembangkan untuk mempelajari bakteri yang biasanya menempati air minum. Spesies bakteri ini cenderung tumbuh lambat dan akan cepat sekali tertekan oleh spesies lain yang berkembang pesat pada medium kultur yang kaya.

7. ANALISIS BIOFILM MENGGUNAKAN PEMBIAKAN • Metode pembiakan yang digunakan untuk melakukan analisis biofilm secara langsung telah ditransfer dari metode yang dikembangkan untuk mendeteksi organisme dalam tahap sampel plankton  pembiakan bakteri heterotrofik, bakteri koliform, ragi dan jamur: • Klebsiella spp., • Escherichia coli, • Enterobacter cloacae dan • Serratia marcescens • Bakteri yang berkaitan dengan partikel dianalisis dengan: • menjebak mereka pada filter (12 µM) yang melalui filter itu 500-2000 liter air • partikel dihilangkan dari membran dengan kocokan di dalam penyangga • bakteri dipisahkan dari partikel dengan proses homogenisasi • sampel-sampel fIok kemudian dihomogenkan secara langsung • tuberkel dan sedimen dihancurkan dan dihomogenkan. • Semua jenis sampel dianalisis untuk kolifom menggunakan metode: • lima tube Most Probable Number (MPN). • Analisis hitungan plat heterotrofik (HPC) • agar R2A • inkubasi pada suhu ruang selama 7 hari, • AS: pour plate yang diinkubasi pada suhu 350 C selama 48 jam • Inggris: agar-agar ekstrak ragi (YEA) maupun R2A sama-sama digunakan.

8. ANALISIS MIKROSKOP TENAGA ATOM • Pemeriksaan biofilm pada baja stainless menggunakan Atomic force Microscopy (AFM). • AFM adalah teknik pemindaian profil permukaan menggunakan sebuah tip (pengungkit) tajam yang terpasang pada alat penopang fleksibel untuk mendeteksi topografi permukaan sampai ke tingkat atom. • Teknik ini menghasilkan gambar tiga-dimensi dari biofilm. • Hanya ada relatif sedikt laporan tentang penggunaan AFM untuk pencitraan biofilm. • Secara umum: karakter teknik dan instrumentasi ini mencegah diterapkannya metode ini secara rutin untuk mendeteksi biofilm  karena meskipun mungkin AFM lebih maju daripada SEM, data yang dihasilkan tidak memberikan identifikasi, viabilitas, atau enumerasi mikroba.

9. PENGUKURAN Aktivitas BIOFILM • Rasio antara jumlah bakteri dan ketebalan biofilm akan bervariasi sesuai dengan sifat dari bakteri, fisiologi dan lingkungannya  pengukuran langsung aktivitas biofilm adalah lebih baik. • Aktivitas biofilm dapat dinilai  menentukan aktivitas adenosin trifosfat (ATP) karena ATP terdapat dalam metabolisme dan menghilang dengan cepat setelah kematian selnya. • Prinsip penentuan ATP  didasarkan pada pengukuran jumlah cahaya yang dihasilkan ketika luciferinteroksidasi karena adanya ATP dan enzim luciferase. • Meskipun tingkat ATP ini tetap konstan setelah dibekukan, metode ini tidaklah standar. Salah satu kelemahan spesifiknya adalah bahwa pengujian ini sensitif terhadap prosedur ekstraksi yang digunakan dan hal ini sangat relevan dengan ekstraksi ATP dari sampel biofilm. • Selain itu, penentuan ATP tidaklah spesifik hanya terhadap bakteri saja, karena pengujian ini tidak membedakan antara prokariota dan eukariota.

10. PENGUKURAN aktivitas BIOFILM (2) • Metode yang lebih berguna untuk mengestimasi aktivitas biofilm, yang dapat diaplikasikan dalam beberapa situasi adalah: • Penentuan aktivitas klorida tetrazolium trifenil (TTC, redox dyes triphenyltetrazolium chloride), • klorida tetrazolium iodofenil (lNT, 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenvl)-5-phenyl tetrazolium chloride) • klorida tetrazolium ditolil siano (CTC, 5-cyano-2, 3-ditolyi tetrazolium chloride). • Zat-zat ini tidak berwarna dan, setelah dikurangai dalam kondisi tertentu, berubah  monoformazan berwarna merah. • keuntungan tambahan CTC: dapat memancarkan sinar fluoresensi merah di bawah sinar ultra violet, yang memungkinkan dilakuakannya deteksi epifluorescence. • Penilaian dengan menggunakan indikator-indikator kimia memberikan ukuran aktivitas pernapasan kumulatif yang telah dikaitkan dengan penentuan viabilitas. • Keuntungan dari pengukuran indikator-indikator aktivitas sistem transpor elektron dalam penentuan ATP: • tidak memerlukan gangguan terhadap proses intraseluler atau ekstraseluler. • Indikator kimia terkurangi oleh dehydrogenase dari bakteri yang memberikan napas untuk sebuah produk formazan larut (fluresensi), yang kemudian dapat dideteksi dengan mikroskop. • Teknik ini telah digunakan dalam analisis sampel lingkungan pembiakan plankton dan sesilia • TTC telah terbukti sangat berkorelasi dengan kadar ATP, konsumsi oksigen dan jumlah sel • TTC sangat sensitif terhadap kehadiran oksigen (INT tidak mengalami masalah ini dan sangat berkorelasi dengan parameter yang lain). • Penentuan TTC, CTC dan INT sensitif terhadap perubahan biokimia dan bergantung pada kondisi fisiologis organisme. Dengan demikian, analisis ini paling tepat untuk penilaian populasi bakteri yang stabil.

11. DETEKSI BERBASIS MIKROSKOP • Memanfaatkan berbagai noda (pewarnaan) mikrobiologi  dilihat dengan menggunakan mikroskop epifluorescence. • Paling sering  acridine oranye (AO), tekniknya  metode penghitungan langsung acridine oranye (AODC, acridine orange diret counting). • AO adalah noda atau pewarnaan asam nukleat, yang ketika digunakan untuk pelabelan mikroorganisme pada umumnya diakui dapat menyediakan ukuran jumlah sel bakteri tersebut. • Telah dikemukakan bahwa variasi dalam warna sel dapat mendiskriminasi antara sel yang aktif (fluoresensi oranye merah) dan sel yang non-aktif (hijau). • Namun demikian, ini bukanlah ukuran atau diskriminasi yang dapat diandalkan, karena kondisi pertumbuhan, prosedur pewarnaan variabel, teknik fiksasi dan adanya gangguan (noise) latar belakang akan mempengaruhi warna sel-sel yang diwarnai dan membuat penghitungan menjadi tidak tepat • AO seharusnya hanya digunakan untuk menghitung jumlah total sel • Solusi 0,02% dari AO dalam 2% formaldehida pada umumnya digunakan dan visualisasi sel AO yang diwarnai dapat dicapai dengan menggunakan filter eksitasi 450-490 nm. • Rhodamine 123 dapat digunakan utk mengukur aktivitas biofilm  dihitung setelah dilakukan fiksasi sampel dengan menggunakan asam iodidapropidium (PI) pada noda nukleat. Senyawa ini dapat menembus membran sel yang tidak aktif dan mengikat asam nukleat untai ganda. Pl sangat tertarik pada cahaya biru dan akan memancarkan warna merah.

12. DETEKSI BERBASIS MIKROSKOP (2) • Pewarnaan yang lebih umum digunakan sekarang untuk mendeteksi jumlah sel total adalah DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol): • Asam nukleat dalam pewarnaan ini mudah divisualisasikan dan bersifat non-diskriminatif dalam kelangsungan hidupnya. • Prosedur pewarnaan ini sederhana untuk dilakukan. • Larutan stok DAPI harus dipersiapkan dan disimpan pada konsentrasi 1-2 µg ml-1 di dalam metanol pada suhu 2-80 C, dalam waktu sampai dengan 1 bulan. • Untuk penggunaan rutin, larutan kerjanya pada umumnya disajikan setiap hari pada konsentrasi 1-2 µg ml-1. • Pewarnaan dilakukan pada suhu kamar minus 5-200 C. • Sinyal positif palsu yang terkait dengan keberadaan bahan organik, seperti yang telah terlihat dalam pendeteksian menggunakan garam tetrazolium, tidak terjadi. • DAPI sangat tertarik oleh cahaya gelombang panjang yang pendek dan fiuoresces berwarna biru, memiliki stabilitas yang baik dan kepunahan yang lambat. • DAPI juga mungkin bisa berguna untuk mempelajari perkembangan biofilm pada tahap awal.

13. Biofilm sampling: On surfaces! • Scratching, scratching, scratching (razor blades, rubber scrapers, cotton swabs etc.) • Removal of parts of support material with biofilms  Laboratory • Expose test surfaces („coupons“), remove after given time  laboratory Biofilm Centre

14. Quantification: • Sample intact or homogenized • Maximum number: nucleic acid stains (acridin orange, DAPI, but: no differentiation live/dead) • Active organisms: • Turbidity • Cultivation methods on various media • Enzymatic activity, incl. Redox • FISH, cell elongation, membrane integrity/potential. • Indirect methods: • oxygen consumption • increase in conductivity (impedance measurement) • CO2 production • production of other metabolites (nitrite, sulfate) • Most important aspect: biomass! • Fouling effects are physical, not physiological Biofilm Centre

15. The key role of monitoring Monitoring = following a process over time  Early warning saves remedy efforts  Efficacy control of cleaning procedures  Optimization of cleaning  Control of anti-fouling strategies Biofilm Centre

16. The classic: Robbins Device Removable surface • Remove test surfaces after given time and investigate in laboratory • Disadvantage: Discontinuous, long time until result obtained The „original“ Robbins device: designed to expose test surfaces adjacent to internal pipe wall in order to simulate similar hydrodynamic conditions Biofilm Centre

17. Biofilm monitoring: The ideal method • The ideal method reveals: • Site/location • Quantity • Thickness • Distribution • Nature of deposit • - organic/inorganic • - biological/abiological • - chemical composition • Stability • Kinetics of formation and removal Biofilm Centre

18. The optimal monitoring method: In situ  In real time  On line  Non destructive  Fast and accurate  Reproducible  Integrates over large surface areas  Easy to handle, stable  Has predictive power and early warning capacity Allows for best prevention and saves money Biofilm Centre

19. System System System Biofilm Biofilm Biofilm Cleaning procedures Sensors Hard-/Software Fouling Critical fouling boarder line time frame Defined alarm boarder line Documentation/Visualisation Defined effectivity boarder line time On-line Monitoring concept System Biofilm Centre

20. The goal: Using monitors for automatic fouling control Modem Dosage Addi-tives Modem Local data processing -> control systems Biofilm Centre

21. Levels of information of some on-line monitoring principles: Level I Scatteredlight (FOS) „Detectionof a deposit Differential turbidity (DTM) on a surface“Pressuredrop Heattransferresistance Weightincrease Velocityofsound Photoacousticspectroscopy Piezo-electricaldevice (PD) Level II FTIR-ATR-spectroscopy (FTIR-ATR) „Biological aspectsofdeposit“Fluorescencespectroscopysensor (FluS) Level III FTIR-ATR-spectroscopy (FTIR-ATR) „Detailedinformation“ Raman spectroscopy X-rayphotoelectronspectroscopy Flemming, H.C. (2003): Role and levels of real time monitoring for successful anti-fouling strategies. Wat. Sci. Technol. 47 (5), 1-8 Biofilm Centre

22. Where to monitor: Membranes? Periphery? • Direct monitoring on membranes is difficult • Approach closest to membrane module situation: • Membrane Fouling Simulator with vertical flux • Bypass device • Important to consider: • Nutrients are potential biomass • Fouling is not restricted to membranes • The chance: • Use other surfaces than membranes for monitoring • Exploit the variety of already existing principles and devices • Put sensor at representative sites, if not into membrane module • Use deposit formation as indicator for possible membrane fouling • Use deposit decrease as indicator for cleaning efficacy Biofilm Centre

23. Level 1: Fibre Optical Device (FOS) active area illuminated area reading area illuminating fiber reading fiber Optical fiber with illuminating and reading areas; Overlapping: active area Tamachkiarow, A., Flemming, H.-C. (2003): On-line monitoring of biofilm formation in a brewery water pipeline system with a fibre optical device (FOS). Wat. Sci. Tech. 47 (5), 19-24 Biofilm Centre

24. Cleaning of sensor 2,5 Cleaning of water pipe 2 1,5 1 Arb. Units 0,5 Nov. Dec. Jan. Febr. March Apr. Mai June Time Performance of FOS in a brewery water pipe Unfortunately: Company Onvida sells measurement, not device Biofilm Centre