INFORME-ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELO PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL TEMA: ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN Y USO DEL BANCO DE GENES BLASTN DOCENTE: HERBERT HERNAN SOTO GONZALES CURSO: BIOTECNOLOGIA ALUMNOS: ANGELA MATIHEL SANCHEZ JAVIER FABRICCIO PANTA AURIS CICLO: VII

2. TABLA DE CONTENIDO 1.INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2 2.OBJETIVOS ............................................................................................................................. 2 2.1. OBJETIVO GENERAL.................................................................................................. 2 2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS .......................................................................................... 2 3.MATERIALES .......................................................................................................................... 2 4.METODOLOGIA ...................................................................................................................... 3 5.CUESTIONARIO ...................................................................................................................... 4 6.RESULTADOS ........................................................................................................................ 10 7.DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................................................ 14 8.CONCLUSIONES .................................................................................................................... 14 9.BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 15

3. ANALISIS DE SECUENCIAS DE ADN Y USO DEL BANCO DE GENES BLASTN 1.INTRODUCCIÓN El ADN es el material que contiene la información hereditaria en los humanos y casi todos los demás organismos. Casi todas las células del cuerpo de una persona tienen el mismo ADN. La mayor parte del ADN se encuentra en el núcleo celular (o ADN nuclear), pero también se puede encontrar una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias (ADN mitocondrial o ADNmt). Las mitocondrias son estructuras dentro de las células que convierten la energía de los alimentos para que las células la puedan utilizar. La secuenciación del ADN es un método de laboratorio utilizado para determinar el orden de las bases dentro del ADN. Las diferencias en la secuencia de los 3 mil millones de pares de bases del genoma humano conducen a la composición genética única de cada persona. En medicina, la secuenciación de ADN se usa para diversos propósitos, incluido el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. En general, la secuenciación permite a los profesionales de la salud determinar si un gen o la región que regula un gen contiene cambios, llamados variantes o mutaciones, que están vinculados a un trastorno. La familia de programas BLAST es la más utilizada para buscar secuencias similares en una base de datos dada una secuencia problema. 2.OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GENERAL Analizar secuencias de ADN utilizando el banco de genes Blastn. 2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Identificar 15 secuencias de ADN al azar. Utilizar el Banco de genes para una identificación más rápida. 3.MATERIALES Laptop Bioedit

4. 4.METODOLOGIA Para comenzar se descargaron los archivos que contenían las estructuras del ADN, luego se abrió utilizando el programa Bioedit y se trabajó con la opción “Open sequenceset” y de ese modo se abre la secuencia de ADN en el programa. Imagen 1: Secuencia de ADN en Bioedit Ahora te vas a la opcion File, seleccionas la opcion “Export as Fasta” y se guarda la secuencia en el bloc de notas. Imagen 2: Secuencia de ADN en el block de notas Una vez que se tiene la secuencia de ADN en el block de notas se copia y se pega en la pagina del NCBI.

5. Imagen 3: Pagina del NCBI Luego de eso configuras algunas opciones, le das a la opcion “explosion”, se abrira una nueva pestana donde saldran los resultados de la busqueda. Imagen 4: Resultados de la búsqueda Tanto el nombre como los demas datos de la secuencia de ADN se colocan de manera ordenada en el cuadro de excel y se analiza si la secuncia es mala,regular o buena. 5.CUESTIONARIO 5.1. ¿Qué es el blasth y como nos ayuda en la práctica? BLAST es el acrónimo de Basic Local Alignment Search Tool. Fué desarrollado por Altschul en 1990 y es el algoritmo más empleado por el NCBI. La principal característica del BLAST es su velocidad, pudiendo tomar pocos minutos cualquier búsqueda en la totalidad de la base de datos. De hecho, los resultados se presentan en pantalla inmediatamente después de calculados. El BLAST puede hacer búsquedas en

6. una base de datos no redundante (nr) la cual tiene los registros no redundantes entre las dos bases de datos principales a nivel mundial: GenBank en USA y EMBL (European Molecular Biology Laboratories) en Europa. En la práctica realizada nos ayudó a identificar rápidamente las secuencias de ADN. 5.2.¿Qué es una secuencia de ADN y como nos serviría en ingeniería ambiental? La secuenciación del ADN significa determinar el orden de los cuatro componentes básicos químicos, llamados "bases", que forman la molécula de ADN. La secuencia les informa a los científicos la clase de información genética que se transporta en un segmento específico de ADN. Por ejemplo, los científicos pueden usar la información de las secuencias para determinar qué tramos de ADN contienen genes y qué tramos transportan instrucciones regulatorias, que activan o desactivan genes. Además, y de manera muy importante, los datos de las secuencias pueden resaltar los cambios en un gen que pueden causar enfermedades. El eDNA en estas áreas de las Ciencias Ambientales se utiliza principalmente para el estudio de las respuestas del medio ambiente ante los cambios provocados por la contaminación. Se usa, además, para averiguar las probabilidades de una especie de sobrevivir o no a un contaminante y así obtener información sobre la gravedad del mismo (Ruppert et al., 2019). Un claro ejemplo del efecto de los contaminantes sobre los ecosistemas y la biodiversidad es el efecto de las prospecciones petroleras sobre los ecosistemas marinos. Gracias a los estudios que utilizan eDNA se ha concluido que los metazoos son los más afectados por la contaminación derivada de la actividad petrolífera, hallándose cambios en las estructuras de las comunidades existentes en el sedimento que rodea la plataforma, que incluían metazoos así como algunos taxones protistas (Lanzén, Lekang, Jonassen, Thompson, & Troedsson, 2016). Se ha observado, además, que existen bacterias que pueden utilizarse como bioindicadores, al sobrevivir en áreas expuestas a los hidrocarburos (que explotan como recurso trófico). La identificación de estas bacterias mediante eDNA permite categorizar el grado de contaminación de un área determinada (Laroche et al., 2018). Del mismo modo Bell et al., (2014) estudiaron las comunidades fúngicas y bacterianas de suelo de las rizosferas de sauces (Salix spp.) y del suelo de una antigua planta petroquímica, obteniendo como resultado cambios drásticos en las comunidades fúngicas y una disminución de la diversidad bacteriana. Los residuos nucleares también son susceptibles de ser identificados e incluso cuantificados mediante eDNA. Así, por ejemplo, Smith et al.,

7. (2015) utilizaron las comunidades microbianas para cuantificar el grado de contaminación por residuos nucleares, y concluyeron, que estas comunidades microbianas pueden ser usadas como marcadores ambientales para evaluar el impacto de los residuos nucleares. 5.3. Dibuje la secuencia del ADN e indique la historia para su descubrimiento Imagen 5: Secuencia del ADN Durante el año de 1869 el biólogo suizo Johann Friedrich Miescher, utilizo alcohol caliente y luego una pepsina enzimática, la cual separa la membrana celular y el citoplasma de la célula, lo que se quería lograr era aislar el núcleo de la célula. Este proceso se llevó a cabo con los núcleos de las células obtenidas del pus de vendajes quirúrgicos desechados y del esperma de salmón, sometiéndolos a estos materiales y a una fuerza centrífuga para aislar a los núcleos y luego realizo un análisis químico a los núcleos. De esta forma Miescher identifico a un nuevo grupo de substancias celulares a las que denomino nucleínas. Observo la presencia de fósforo, después Richard Altmann los identifico como ácidos y les dio el nombre de ácidos nucleicos. En 1914 Robert Feulgen describió un método para revelar el ADN, basado en la colorante fucsina. En el transcurso de los años 20, el bioquímico P.A. Levene realizo un análisis a los componentes del ADN y encontró que contenía cuatro bases nitrogenadas: citosina y

8. timina, adenina y guanina; azúcar desoxirribosa; y fosfato. También señalo que se encontraban unidas en un orden definido el cual es: fosfato-azúcar-base, formando lo que llamo nucleótido. Levene también expuso que los nucleótidos se encontraban unidos por los fosfatos formando el ADN. James Watson y Francis Crick, ellos descubrieron la forma que del ADN al interior de la célula: una hélice doble, que le permite replicarse y traspasar información de una generación a otra. Este descubrimiento fue el punto de partida para el estudio del genoma. Desde aquella fecha hasta hoy han pasado 50 años, y los avances de la Genética han sido enormes. 5.4.¿Qué es el método de secuencia de sanger? Se basa en sintetizar, de forma secuencial, una hebra de ADN complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en presencia de ADN polimerasa, los cuatro 2’-deoxinucleótidos que componen la secuencia del ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP).Estos últimos nucleótidos “especiales” o nucleótidos de parada, están diseñados para que carezcan del grupo 3’-OH, que permite la adición del nucleótido consecutivo, de forma que cuando uno de ellos es incorporado por la polimerasa se interrumpe la síntesis de la nueva hebra. Esto lleva a que se obtengan fragmentos secuenciados de diferente tamaño, según dónde se incorporen los dideoxinucleótidos. De este modo, y tras una simple electroforesis, se va a poder dilucidar la secuencia. 5.5.Dibuje toda la metodología de secuenciación de ADN (secuenciación sanger Imagen 6: Secuencia sanger

9. 5.6.¿Cuántos tipo de secuenciación de ADN existen actualmente? Existen dos tipos de secuenciación Métodos clásicos: Método químico de Maxam y Gilbert y Método enzimático de Sanger Secuenciación automática empleando el metodo enzimático: Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. 5.7.Los 15 archivos que usted analizo a que ser vivo corresponden Imagen 7: Secuencias de ADN analizadas calidad de la secuencia Especie identificada % N° codigo sec F10.14.12 G07.7H.13 F09.6.11 H09.8.15 H10_16_16 7_G03_13 2_B03_03 5_E03_09 11-375NZ_C02_06 14-483H_F02_12 09-419YZ_A02_02 DIVERSOS-_B07_2H_03 USER_04set2007_09-419YZ_A02_02 USER_04set2007_15-456NZ_G02_14 USER_04set2007_03-419AZ_C01_05 USER_04set2007_08-375H_H01_15 mala regular buena N.I. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Klebsiella sp. ICBR 115 Klebsiella sp. N.I. Enterobacter sp. IICDBZ9 N.I. uncultured soil bacterium Enterobacter sp. Klebsiella pneumoniae Klebsiella quasipneumoniae Enterobacter cloacae 94.36% 81.75% 86.93% 71.52% 93.01% 77.47% 88.50% 96.81% 74.24% 95.81% 91.54% 97.35% 0.7375 Stenotrophomonas sp. UYSB32 16S gen de ARN ribosomal, secuencia parcial Enterobacter sp. Gen del ARN ribosomal CB7 16S, secuencia parcial Bacillus thuringiensis cepa BT62 cromosoma, genoma completo Klebsiella sp. cromosoma MPUS7, genoma completo Klebsiella oxytoca cepa ac1w1-1 gen de ARN ribosomal 16S, secuencia parcial 5.8.Realice una breve sinopsis de la historia de secuenciación de los ácidos nucleicos Gregor Mendel realizó sus experimentos de hibridación con plantas de arvejas (Pisum sativum), encontrando que las nuevas características que presentaban las plantas, eran el resultado de la mezcla de los caracteres iniciales que poseían las plantas. Por primera vez, en 1871, Johann Meisher hace una descripción del ácido desoxirribonucleico (DNA) en el esperma de la trucha, y en 1944 tres investigadores: Oswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty, demuestran que el DNA es la molécula en donde se encuentra la información genética. En la década de 1940, Frederick Sanger, investigador del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Cambridge, estaba interesado en el metabolismo de los aminoácidos y en la secuenciación de estos en una proteína de gran interés biológico: la insulina. En esa época no se conocía la estructura del DNA, por lo que su investigación

10. se enfocaba en la elucidación estructural de las proteínas, compuestos que se creía conformaban el material genético. La determinación de que las cantidades de adenina y timina y las de citosina y guanina son las mismas, es un gran aporte que hace Erwin Chargaff en 1950 y que, posteriormente, se constituyó en la "Regla de Chargaff. A principios de la década de 1970 Allan M. Maxam y Walter Gilbert adscritos al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Harvard, investigan sobre la secuenciación del DNA y en febrero de 1977 publican, en Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, un artículo que titularon "A New method for sequencing DNA" en el que afirman que el DNA puede ser secuenciado por un procedimiento químico, mediante el cual es posible determinar la secuencia de nucleótidos del DNA. Frederick Sanger, tomando en consideración lo reportado por Meselson y Stahl, desarrolla un método de secuenciación de pequeños fragmentos de DNA cuyo enfoque diferencial, frente a la propuesta de Maxan y Gilbert que era eminentemente química y tomaba al menos un día, fue la utilización de síntesis enzimática de la cadena complementaria del fragmento de ADN a secuenciar. Utilizando esta estrategia, Sanger y colaboradores, en 1978, realizan la secuenciación total del bacteriófago Φ-X174 y desde entonces es el método más utilizado para determinar secuencias de DNA. Hasta este momento la secuenciación era un proceso manual, pero en 1982 Marvin Caruthers y Leroy Hood desarrollan el primer método automatizado para secuenciar DNA, el cual era capaz de secuenciar fragmentos de 5 a 75 pares de bases (pb) y, en 1986, Leroy Hood y Lloyd Smith diseñan el primer secuenciador automático que utiliza rayos láser que reconocen marcadores de fluorescencia en el DNA. 5.9.¿Qué es el bioedit? Bioedit es un programa gratuito para edición de alineamientos y análisis de secuencias que funciona únicamente sobre ambiente MS/Windows. Es, sin lugar a duda, uno de los programas más conocidos para edición de secuencias para dicho sistema operativo. 5.10. ¿Qué es el NCBI (National Center Biotecnology Investigation) incluir su historia?

11. El Centro Nacional para la Información Biotecnológica es parte de la Biblioteca Nacional de Medicina de Estados Unidos, una rama de los Institutos Nacionales de Salud. Está localizado en Bethesda (Maryland). Fundado el 4 de noviembre de 1988, y ubicado en Bethesda, Maryland, el National Center for Biotechnology Information es una división de la National Library of Medicine, uno de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Como recurso nacional de información sobre biología molecular y uno de los más poderosos en las llamadas ciencias de la vida en general, el centro desarrolla constantemente nuevas tecnologías de información para ayudar a comprender, tanto los procesos genéticos, como moleculares que controlan la salud y la enfermedad. El sitio del NCBI, conformado por un amplio y diverso banco de bases de datos, herramientas y otros medios, posibilita la exploración integral de sus recursos mediante un sistema de recuperación (un gran motor de búsqueda) de interfaz única denominado Entrez, The Life Sciences Search Engine, distribuido por primera vez en 1991, que permite la búsqueda simultánea de información generalmente de carácter público sobre los más diversos aspectos de las ciencias de la vida y la salud en decenas de bases de datos de una calidad excepcional. El NCBI agrupa sus bases de datos esenciales en tres grandes sectores: Literature Databases, Molecular Databases y Genomes. Estas dos últimas clases comprenden un grupo amplio y diverso de bases de datos biológicas cuya información procede básicamente de los resultados de experimentos científicos, suministrados directamente por los laboratorios o instituciones que los realizan o publicados en la literatura científica especializada, donde con frecuencia se aplican tecnologías de experimentación de muy alto rendimiento y el análisis computacional. La información contenida en estas bases de datos comprende: funciones, estructura y localización (tanto celular como cromosómica) de los genes, los efectos clínicos de las mutaciones, así como las similitudes entre secuencias y estructuras biológicas. 6.RESULTADOS Los resultados obtenidos del software BLASTn son los siguientes: En la primera secuencia se identificó como Klebsiella sp. ICBR 115 Imagen 8: Identificación de secuencia 1

12. En la segunda secuencia se identificó como Klebsiella sp. Imagen 9: Identificación de secuencia 2 En la tercera secuencia no se pudo idénticar. Imagen 10: Identificación de secuencia 3

13. La cuarta secuencia se identificó como Enterobacter sp. IICDBZ9 Imagen 11: Identificación de secuencia 4 Se continuo con la misma metodología para las siguientes siendo los resultados agrupados en una tabla: Tabla 12: Secuencias de ADN identificadas

14. calidad de la secuencia Especie identificada % N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 codigo sec G07.7H.13 F09.6.11 H09.8.15 H10_16_16 7_G03_13 2_B03_03 5_E03_09 11-375NZ_C02_06 14-483H_F02_12 09-419YZ_A02_02 DIVERSOS-_B07_2H_03 USER_04set2007_09-419YZ_A02_02 USER_04set2007_15-456NZ_G02_14 USER_04set2007_03-419AZ_C01_05 USER_04set2007_08-375H_H01_15 mala regular buena Klebsiella sp. ICBR 115 Klebsiella sp. N.I. Enterobacter sp. IICDBZ9 N.I. uncultured soil bacterium Enterobacter sp. Klebsiella pneumoniae Klebsiella quasipneumoniae Enterobacter cloacae 94.36% 81.75% 86.93% 71.52% 93.01% 77.47% 88.50% 96.81% 74.24% 95.81% 91.54% 97.35% 0.7375 Stenotrophomonas sp. UYSB32 16S gen de ARN ribosomal, secuencia parcial Enterobacter sp. Gen del ARN ribosomal CB7 16S, secuencia parcial Bacillus thuringiensis cepa BT62 cromosoma, genoma completo Klebsiella sp. cromosoma MPUS7, genoma completo Klebsiella oxytoca cepa ac1w1-1 gen de ARN ribosomal 16S, secuencia parcial Se pudo identificar 13 de las 15 secuencias de ADN teniendo grados de similitud altos. De las cuales se identificó en que ser vivo están presentes y alguna característica. Klebsiella sp. ICBR 115 , Klebsiella sp. y Enterobacter sp. IICDBZ9 residen en el intestino de muchas personas sanas, causando raras veces infección. Las infecciones con dichas bacterias suelen adquirirse en hospitales y centros de atención a largo plazo. Stenotrophomonas sp. anteriormente conocida como Xanthomonas maltophilia y Pseudomonas maltophilia es un bacilo Gram negativo no fermentador de la glucosa, reconocido como agente causal de diversas infecciones nosocomiales, además de presentar resistencia a múltiples agentes antimicrobianos. Imagen 13: Stenotrophomonas sp.

15. 7.DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los datos de la secuenciación de ADN tienen un valor limitado a menos que la información sea útil biológicamente, por lo que la bioinformática pasa a ser una parte crítica de la secuenciación del ADN. La comparación de secuencias puede conducir a la identificación de los genes y otros patrones de secuencias conservadas. Además, la comparación de secuencias se puede utilizar para establecer relaciones funcionales, estructurales y evolutivas entre genes. Otra ventaja potencial es que la comparación de secuencias proporciona un método fiable para deducir las funciones biológicas de los genes recién secuenciados. Una de las bases de datos más grandes y más influyentes es la GenBank. Esta base de datos de código abierto contiene más de un billón de secuencia de nucleótidos, son datos públicamente disponibles. Cada entrada en GenBank contiene una secuencia y un número de acceso único, así como la ayuda de anotaciones bibliográficas y biológicas tales como referencias de autor y datos taxonómicos. El NCBI supervisa y mantiene la base de datos, pero cada entrada la presenta directamente cada laboratorio de forma individual. La presentación directa ha permitido que la base de datos mantenga un rápido ritmo de crecimiento en la cantidad de datos de secuencias. Sin embargo, esto también significa que existe heterogeneidad en la calidad de las entradas, especialmente en la certeza de la identidad de cada nucleótido y en la medida de las anotaciones adjuntas. El impacto de esta incertidumbre puede variar en función de los objetivos del estudio, las propiedades físicas de la región(es) de ADN, y el método de secuenciación elegido. Para solucionar esto, GenBank clasifica la información de las secuencias en base a la estrategia de secuenciación utilizada para obtener los datos 8.CONCLUSIONES BLAST resulta el algoritmo a escoger en una búsqueda preliminar de similitud entre una secuencia problema y las bases de datos disponibles. Provee como primer resultado una medida cuantitativa de la similaridad de la secuencia problema contra cada una de las secuencias de la base de datos. Es una herramienta de alineamiento local por pares. Consiste en hacer coincidir un par de secuencias. Es decir, sólo producen alineamientos por pares de la secuencia problema con cada una de las secuencias de la base de datos con las que muestra alta similitud.

16. El almacenamiento de datos aparece en la bioinformática para apoyar el descubrimiento de los conocimientos biológicos y también para facilitar la investigación y el intercambio de información. Se considera que las aplicaciones web biológicas colaborativas han revolucionado la investigación biológica. Muchas de las investigaciones recientes probablemente sean en las ciencias biológicas y de la salud, por lo que se busca que se busca un enfoque investigativo desde la informática hacia esta área. Como trabajo futuro se requiere definir las plataformas tecnológicas y la implementación de los procesos asociados a la solución propuesta. No obstante, en esta fase los investigadores ven representados sus intereses y requerimientos lo que es condición fundamental para el éxito del sistema planteado. 9.BIBLIOGRAFÍA Entrez Genome Database Search. National Center for Biotechnology Information. Search for details on specific genomes by organism name and strain. International Human Genome Sequencing Consortium (2001). Initial sequencing and analysis of the human genoma. Búsqueda de secuencias utilizando BLAST — Bioinformatics at COMAV 0.1 documentation. (s. f.). Bioinfo. Recuperado 19 de mayo de 2022, de https://bioinf.comav.upv.es/courses/intro_bioinf/practica_blast.html EMBnet Colombia - Centro de Bioinformà ¡tica del Instituto de BiotecnologÃa. (s. f.). Bioinfo. Recuperado 20 de mayo de 2022, de http://bioinf.ibun.unal.edu.co/documentos/Blast/blast.php