IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (PRECIPITÁCIÓ)

1. IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (PRECIPITÁCIÓ)

2. IMMUNKOMPLEX Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott szolubiliskomplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlancsapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

3. Precipitációs görbe ellenanyagtúlsúly EKVIVALENCIA antigéntúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

4. Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: • -valencia • -pH • hőmérséklet (pl., hideg agglutininek /IgMantitestek/ 4 °C,és meleg agglutininek • /IgG antitestek/ 37 °C által mediált autoimmun hemolítikus anémiák) • sókoncentráció • idő (antigén-antitest kötődés pillanat alatt, míg a precipitátumhoz több óra kell) • egyéb (pl. PEG) – az oldékonyságot csökkenti IgA-dimer IgM-pentamer

5. MÓDSZEREK Immundiffúzió: - radiális egyszerű (Mancini) - radiális kettős (Ouchterlony) Elektroforézis: - immunoelektroforézis - rakéta elektroforézis - két-dimenziós elektroforézis - izoelektromos fókuszálás és immunofixálás Nefelometria (fény csökkenés mérése) Turbidimetria(fényszórás mérése)

6. Az optimális arányt adó antigén koncentráció. Antigén koncentráció Antigént tartalmazó lyuktól való távolság IgG koncentráció (mg/ml) Precipitációs gyűrű A gyűrű átmérője IgG koncentráció mérése stérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén (Ag1) a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval

7. Bakteriális extra-intracelluláris enzimek, anyagcseretermékek Pl., koaguláz termelés (S. aureus) A precipitációs gyűrű átmérője Ag koncentráció

8. Radiális kettős immundiffúzió

10. „Rakéta elektroforézis” Elektroimmunodiffúzió (Laurell) A rakéta alakú precipitációs csúcsok magassága arányos az antigén koncentrációjával koagulációs faktorok kimutatása (pl., vWF, trombin aktivitás)

11. Immunprecipitáció Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők. Immunelektroforézis

12. Gammopátiák diagnosztikája: M komponens kimutatása zónaelektroforézis és immunoelektroforézis segítségével

13. Szerológiai módszerek alkalmazása Immundiffúzió:pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer):antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék ( immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony módszer):precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis:szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis:antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis:elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók (pl: szérum fehérjék) koncentrációjának meghatározása, szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérjeösszetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata Nefelometria:(érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése

14. Az in vivo képződő immunkomplexek eltávolításának mechanizmusai Y Y Y Y Y blokkolás Y Y Y Y Y Y Y oldás precipitálás • oldható komlexek • kimutatása • fizikai méret • ppt (PEG, stb.) • Anti-Ig • Anti-C3 • C1q kötés • sejthez kötődés • C3 receptor • Fc receptor C1q C1r, C1s (aktív enzim) C4, C2 VVT gyulladás CR1 C3a lízis C5,6,7,8,9 C3 Y CR3 C3b memória B-sejtek Y FcR fagocitózis citotoxicitás Makrofág

15. Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás • A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. • Fajtái: • direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása • kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM • indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. • DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez • kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén(Rh)) (IgG) • passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók (rheumatiodarthritis). • A szérumbana saját IgG-vel reagáló IgM és IgGautoellenanyagok (RF) jelennek meg.

17. - reakció gyors ülepedés - reakció gyors ülepedés + reakció lassú ülepedés

18. Direkt agglutináció IgM antitest pl. AB0 vércsoport meghatározás vörös-vértest

19. Az ABO vércsoportantigének szerkezete O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.

20. Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható! - + + + - - + + + - - + - - - -

21. Vércsoport meghatározás Ágy melletti gyorsteszt Microplate-s meghatározás Hagyományos csempés meghatározás Gélkártyás technika

22. Indirekt agglutináció IgG primer ellenanyag(antitest) vörös-vértest IgG szekunderellenanyag(antitest) pl. Rh vércsoport meghatározás

23. A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) D antigén FEHÉRJE ANTIGÉN A VÖRÖSVÉRTESTEKEN extracelluláris tér citoplazmamembrán intracelluláris tér Anti-D antitest IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

25. ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF –ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Az agglutináció in vivo következményei Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

26. Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF = reuma faktor) jelennek meg. Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RFvan jelen.

27. Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül? (Nem immunológiai reakció!!!) Igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

28. Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció: ABO vércsoport meghatározás Widal-teszt: tiphoid láz, febris undulans indirekt agglutináció: anti-D Ea jelenlétének kimutatása direkt Coombs-teszt: vércsop. inkompatibilitás, autoimmun hemolitikus anémia indirekt Coombs-teszt: transzfúzió előtt, terhesség alatt passzív agglutináció: rheuma faktor kimutatása terhességi monoteszt