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Começando a decifrar...

Começando a decifrar. O fenômeno de restrição-modificação. Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962. Enzimas de restrição. Clivagem de restrição. Sítio de Restrição.

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Presentation Transcript

  1. Começando a decifrar...

  2. O fenômeno de restrição-modificação Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962

  3. Enzimas de restrição

  4. Clivagem de restrição

  5. Sítio de Restrição

  6. Nomenclatura das enzimas de restrição EcoRI Escherichia coli BamHIBacillus amyloliquefaciens RH BglIIBacillus globigii PvuIIProteus vulgaris HindIIIHaemophilus influenzae Rd HinfIHaemophilus influenzae Rf Sau3AStaphylococcus aureus AluIArthrobacter luteus TaqIThermus aquaticus HaeIIIHaemophilus aegyptius NotI Nocardia otitidis-caviarum

  7. Fracionamento de DNA

  8. Mapa de Restrição

  9. Utilização do Mapa

  10. Detectar mutações

  11. Comparação de Mapas

  12. Fracionamento de DNA

  13. Como reconhecer o fragmento de interesse?

  14. Complementariedade

  15. Hibridação Calor ou pH = desnaturação

  16. Reassociação Temperatura e força iônica

  17. Sonda

  18. Marcação da sonda

  19. Estringência • Reação de Hibridação e Lavagem: • especificidade da sonda • tamanho da sonda • temperatura (T’m) • força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: T’m - 25oC Força iônica: NaCl

  20. Southern blot

  21. Resultado

  22. Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI

  23. Southern blotAnimação

  24. O que fazer com o fragmento? Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.

  25. Vetores de clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem? 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem

  26. Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

  27. Plasmídio recombinante

  28. Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção, multiplicação

  29. Hospedeira transformada

  30. Clonagem molecular

  31. Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.

  32. Biblioteca GenômicaGenoteca

  33. Varredura de biblioteca

  34. Seqüenciamento de DNA Princípios

  35. Reação em cadeia de polimerização 1. Replicação

  36. PCR 2. Amplificação

  37. PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.

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