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TGN1412: ¿Por qué la estructura es importante?

TGN1412: ¿Por qué la estructura es importante?. Bergerat D, Delgado A, Fernandez M, Moreno M, Rico V, Ruiz S, Sió M, Subirana I, Tirado E, Villalobos X. índice. Planteamiento de las hipótesis Objetivo 1: Estructura inmnoglobulinas Plegamiento Ig-like Modelos cadenas ligera y pesada

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TGN1412: ¿Por qué la estructura es importante?

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Presentation Transcript

  1. TGN1412: ¿Por qué la estructura es importante? Bergerat D, Delgado A, Fernandez M, Moreno M, Rico V, Ruiz S, Sió M, Subirana I, Tirado E, Villalobos X

  2. índice • Planteamiento de las hipótesis • Objetivo 1: • Estructura inmnoglobulinas • Plegamiento Ig-like • Modelos cadenas ligera y pesada • Interacciones • Objetivo 2: • CD28 Macaca fascicularis • CD28 Mus musculus • Objetivo 3: • Unión de la Fc al receptor Fc • Agregados • Objetivo 4: • Siglecs • Suplemento • Bibliografía

  3. OBJETIVO 1 Alineamiento basado en secuencia Alineamiento basado en estructura

  4. ESTRUCTURA INMUNOGLOBULINAS Fab CDRs Fc

  5. PLEGAMIENTO IG-LIKE SandwitchGreek Key Dominio CH/CL Clasificación Dominio VH/VL

  6. PLEGAMIENTO IG-LIKE Dominio VL Dominio CL

  7. PLEGAMIENTO IG-LIKE Clasificación

  8. ESQUEMA GENERAL Edición PDB 1YJD PDB TGN1412+ CD28

  9. OBTENCIÓN DE LA SECUENCIA Humanizar manualmente IgG humana IgG murina A partir de la patente OBTENCIÓN DE LA SECUENCIA • Humanizar manualmente • IgG humana • IgG murina Sustituir en la IgG humana sus CDRs por los murinos Sustituir en la IgG humana sus CDRs por los murinos Identificar CDRs Identificar CDRs

  10. PATENTE: Cadena ligera (LC) framework CDR L1: 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 http://www.bioinf.org.uk/

  11. PATENTE: Cadena pesada (HC) CDR H3: 99-109 CDR H1: 31-35 framework CDR H2: 50-66 http://www.bioinf.org.uk/

  12. LC: Patrones Un único patrón  pdb 1YJD (murino) Clustalw TGN1412 – 1YJDL Secuencia fasta LC TGN1412 (modificada) Más de un patrón  PSI-BLAST: búsqueda de homólogos remotos

  13. LC: Patrones Score: 75

  14. LC: Patrones Un único patrón  pdb 1YJD (murino) Clustalw TGN1412 – 1YJDL Secuencia fasta LC TGN1412 (modificada) Más de un patrón  PSI-BLAST: búsqueda de homólogos remotos 1º Contra SWISSPROT 2º Contra PDB

  15. LC: Patrones

  16. LC: Patrones Un único patrón  pdb 1YJD (murino) Clustalw TGN1412 – 1YJDL Secuencia fasta LC TGN1412 (modificada) Más de un patrón  PSI-BLAST: búsqueda de homólogos remotos 1º Contra SWISSPROT 2º Contra PDB

  17. LC: Alineamiento basado en secuencia

  18. LC: Alineamiento basado en secuencia Score: 75

  19. LC: Alineamiento basado en secuencia Únicamente alinea el dominioIg-like una vez!!!

  20. LC: Alineamiento basado en secuencia V X

  21. LC: Alineamiento basado en secuencia V X

  22. LC: Alineamiento basado en secuencia Score: 59

  23. Alineamiento estructural de los patrones: STAMP Estándar output Obtención del alineamiento y del pdb LC: Alineamiento basado en estructura

  24. LC: Superposición patrones RMS : 1.64 Lenght: 214 Nfit: 208

  25. Construcción Modelo de Markov: HMMBUILD Alineamiento LC TGN1412 – patrones: HMMALIGN Obtención del modelo: MODELLER LC: Alineamiento basado en estructura

  26. LC: Resultados Hasta el momento hemos obtenido: 4 modelos basados en secuencia 2 con un patrón 2 con más de un patrón 2 modelos basados en estructura ¿Cuál es el mejor?

  27. Evaluación Energética: PROSA II (energía pair modelos) LC: Evaluación modelos

  28. LC: Evaluación modelos Evaluación Energética: PROSA II (energía pair patrones) Patrón murino 1YJD CDR2 CDR3

  29. Evaluación Energética: PROSA II (energía pair modelos) LC: Evaluación modelos Modelo Sec1 Modelo Sec2

  30. LC: Evaluación modelos Evaluación Estereoquímica: PROCHECK

  31. LC: Evaluación modelos Evaluación Estereoquímica: PROCHECK

  32. LC: Evaluación modelos Evaluación Energética: PROSA II Z-score N= 214

  33. LC: Modelo definitivo VL CL

  34. LC: Modelo definitivo CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3

  35. LC: STAMP murina-humanizada Patrón murino Modelo Sec2 RMS : 0.92 Lenght: 212 Nfit: 211

  36. LC: STAMP murina-humanizada Patrón murino Modelo Sec2

  37. HC: Patrones Un único patrón pdb 1YJD Secuencia fasta 1yjdH Clustalw

  38. HC: Aliniamiento basado en secuencia Un único patrón CLUSTALW Score: 75

  39. HC: Resultados ¿Cuál es el mejor modelo?

  40. HC: Evaluación de los modelos • Evaluación estereroquímica PROCHECK • Evaluación energética  PROSA II N= 221

  41. Evaluación energética  PROSA II Perfil energético HC: Evaluación de los modelos Modelo 1 Modelo 2 Patrón (1yjdH)

  42. HC: Evaluación de los modelos 1YJDH MODEL2_CLW 1yjdH Model2_clw

  43. HC: Evaluación de los modelos Score: 75

  44. HC: Modelo definitivo VH CH

  45. HC: Modelo definitivo CDR H1 CDR H2 CDR H3

  46. HC: STAMP murina-humanizada 1YJDH Modelo2_clw RMS : 0.80 Lenght: 218 Nfit: 216

  47. HC: STAMP murina-humanizada Patrón murino Modelo Sec2 RMS : 0.80 Len: 218 Nfit:216

  48. HC - LC TGN1412 i CD28: Stamp CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3

  49. HC - LC TGN1412 i CD28: STAMP CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3 CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 Loop C’’D

  50. INTERACCIONES • Comparamos las interacciones entre: • el CD28 humano y el AC murino (cristal) • el CD28 humano y el modelo TGN1412 • ¿Por qué? Podría ser que durante la humanización se hubieran provocado cambios estructurales que modificaran la interacción del TGN1412 con el CD28.

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