UBA III – Biologia Molecular

1. UBA III – Biologia Molecular Aula Laboratorial 12012/2013 Maria José Correia mariacorrei@gmail.com

2. Sumário L1 • Apresentação sucinta do programa das aulas laboratoriais; • Segurança no laboratório • Introdução às técnicas básicas para o estudo dos ácidos nucleicos • Isolamento e purificação de DNA • Digestão de DNA: • Digestão de DNA do bacteriófago λ com enzimas de restrição. UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

3. Programa UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

4. Segurança no laboratório UBA-III Biologia Molecular 2012/2013 • Regras gerais: • Nunca trabalhar sozinho! • Nunca COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes de contato ou cosméticos! • Nunca cheirar soluções ou reagentes • Nunca pipetar com a boca • Lavar imediatamente a pele após contato com culturas/químicos

5. Segurança no laboratório UBA-III Biologia Molecular 2012/2013 • Atitudes: • Usar o senso comum (a maioria dos acidentes de laboratório começa com algo simples); • Estar consciente – conhecer os reagentes antes de os usar (ler os rótulos, etc.) • Estar protegido – conhecer as práticas e equipamentos que podem aumentar a proteção (máscaras, luvas, etc.)

6. Segurança no laboratório • Bancada: • As bancadas de trabalho devem ser mantidas organizadas e limpas • Identificar todo o material utilizando para isso marcadores de vidro apropriados • Os lixos devem ser perfeitamente identificados • O material de vidro estalado ou partido deve ser imediatamente rejeitado UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

7. Segurança no laboratório • Protecção pessoal: • Usar bata e manter os cabelos compridos apanhados; • Usar a hotte sempre que necessário; • Antes de abandonar o laboratório , limpar a bancada, retirar a bata e lavar as mãos. UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

8. Instruções gerais UBA-III Biologia Molecular 2012/2013 Ler os protocolos antes de cada aula prática Seguir atentamente as instruções fornecidas pelo docente antes de executar o trabalho proposto Depois de terminar o trabalho de cada aula arrumar a bancada. Colocar o lixo e o material contaminado nos locais apropriados.

9. Introdução às técnicas para estudar os ácidos nucleicos • Manipulação de moléculas de DNA • Isolamento e purificação de DNA genómico • Enzimas de restrição • Separação em gel de agarose • Aplicações biotecnológicas UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

10. Técnicas de extração de DNA genómico • DNA • lise celular • libertação de todo o material intracelular • precipitação de proteínas e detritos celulares • purificação do DNA UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

11. Lise celular • Lise mecânica/física • Homogenizador • Ultra-sonicador • French pressure cell press • Fervura e pressão osmótica • Lise alcalina • soluções fortemente alcalinas (de hidróxido de sódio) • SDS (dodecil sulfato de sódio) • Lise enzimática • Proteases • Rnases UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

12. Precipitação diferencial • Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico • Fenol e clorofórmio desnaturam as proteínas • Fase fenólica (proteínas em solução) separa-se da fase aquosa (DNA) • Precipitação com etanol absoluto (ou isopropanol) • Insolubilidade do DNA em etanol • Presença de catiões monovalentes • Lavagem com 70% etanol • Dissolução dos catiões • DNA puro no precipitado UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

13. Extração de ácidos nucleicos amostras diversas lise celular Precipitação de proteínas Lavagem e precipitação de DNA Ressuspensão do DNA em TE (pH8.0) ou em água estéril UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

14. Determinação da concentração e grau de pureza • Método espetrofotométrico • A absorvância a 260nm é proporcional à quantidade de ácidos nucleicos • A absorvância a 280nm que é proporcional à quantidade de proteínas e fenol • O grau de pureza é frequentemente estimado através da razão A260/A280 que deve ser entre 1,8 e 2,0 UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

15. Separação de diferentes fragmentos de DNA em função da sua mobilidade num campo eléctrico Eletroforese em gel de agarose http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

16. Enzimas que reconhecem pequenas sequências de DNA (4 a 8 nucleótidos) Cortam o DNA de cadeia dupla no interior dessa sequência ou num local adjacente a ela. Catalisam a quebra de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos. Geram dois fragmentos cujos terminais podem ser: coesivos cegos Endonucleases ou enzimas de restrição UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

17. Isosquisómeros • reconhecem e cortam a mesma sequência MboI GATC NdeIIGATC Neosquisómeros • reconhecem a mesma sequência mas cortam ligações distintas. SacI GAGCTC EcoICRI GAGCTC Enzimas de restrição UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

18. Célula bacteriana DNA E. coli Entrada do DNA λ Ciclo lisogénico Ciclo lítico Fago λ Replicação do DNA λ DNA λ activação DNA λ integrado no genoma bacteriano Lise bacteriana e libertação do DNA λ Neste trabalho… • Bacteriófago λ • (≈ 48,5 pb) • Enzimas de restrição • (Produzem terminais coesivos) análise dos padrões de restrição UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

19. L = DNA λ P = PstI (Digestão do DNA λ) E = EcoRI (Digestão do DNA λ) H = HindIII (Digestão do DNA λ) Amarelo Violeta Verde Laranja Enzimas de restrição Preparação das amostras • Colocar as amostras em gelo: • Identificar os tubos para as reacções de digestão UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

20. 37ºC Tubo DNA RB PstI EcoRI HindIII Preparação das amostras • Pipetar os reagentes de acordo com a tabela : Micropipetas!!! • Misturar os reagentes e incubar a 37ºC, durante 30 minutos Trazer régua na próxima aula UBA-III Biologia Molecular 2012/2013