Microscopi e tecniche microscopiche

1. Microscopi e tecniche microscopiche Possiamo dividere i microscopi a seconda del tipo di onda utilizzata per visualizzare le immagini Microscopi Ottici Microscopi Elettronici Permettono di osservare strutture troppo piccole per essere osservate ad occhio nudo

2. L’ISTOLOGIA ED I SUOI METODI DI STUDIO Per un appropriata comprensione di qualsiasi ramo delle scienze è indispensabile una certa familiarità con gli strumenti e i metodi ad esso propri. La comprensione della morfologia e cioè dell’organizzazione strutturale delle cellule e dei tessuti è un requisito essenziale per comprendere come essi funzionano. Le piccole dimensioni delle cellule e dei componenti della matrice rendono l’istologia dipendente dall’impiego e dal progredire dei microscopi.

3. visualizzazionedi cellule e tessuti Il microscopio è uno strumento fondamentale Storicamente gli studi su cellule, tessuti e organi si sono basati sull’impiego di diversi tipi di microscopi e sulle relative procedure Esistono diversi metodi di microscopia, e la microscopia ottica è stata ed è tuttora la piu’ ultilizzata anche a scopo didattico

4. DIMENSIONIBIOLOGICHE E DIVERSITA’ DELLE CELLULE

5. UNITA’ DI MISURA μm 20 μm 1X5 μm 25 nm 7 nm 2nm

6. microscopia ottica Negli ultimi anni la microscopia ottica è diventata ancora più importante, soprattutto a causa dello sviluppo di metodi per la marcatura specifica per la visualizzazione di singoli costituenti cellulari e la ricostruzione della loro architettura Tridimensionale. Un vantaggio importante della microscopia ottica è che la luce è relativamente poco distruttiva Marcando componenti cellulari specifici con marcatori fluorescenti, possiamo cosi’ osservare i loro movimenti e le loro interazioni in cellule e organismi viventi

7. microscopia in campo chiaro Il tipi piu’ diffuso di microscopio è quello illuminato a campo chiaro (BFM-bright-field Microscope) perché è poco costoso, facilmente trasportabile ed è in grado di fornire molte informazioni sulla struttura di cellule,tessuti ed organi. Con il BFM si possono studiare cellule viventi, (in vivo) e piccole parti di tessuti o di organi. Limiti: dimensioni del preparato, la risoluzione, l’ingrandimento ed il contrasto.

8. Immagini al M.O.

9. Microscopia ottica • Una funzione cellulare è correlata alla sua morfologia • 2 micron-1 metro in lunghezza • rotonde,discoidali,con estensioni • filiformi, cubiche, • piramidali

10. Immagini al Microscopio a fluorescenza

11. L’ingrandimento è il rapporto tra la dimensione dell’immagine e quella dell’oggetto osservato. Il limite superiore effettivo dell’ingrandimento è da 1000 a 1200 diametri (diametro dell’oggetto) Con l’aumentare dell’ingrandimento, il diametro di campo Si restringe e diminuisce la possibilità di dedurre la forma Generale degli oggetti di maggiori dimensioni La risoluzione del microscopio in campo chiaro è di circa 0,25 m

12. La microscopia otticaè limitata nella finezza dei dettagli che può rivelare, i microscopi che utilizzano altri tipi di radiazioni, -in particolare il microscopi elettronici- possono risolvere strutture molto piu’ piccole di quelle che è possibile risolvere con la luce visibile Gli svantaggi della microscopia elettronica sono che la preparazione dei campioni è molto piu’ complessa ed è piu’ difficile essere sicuri che cio’ che vediamo nell’immagine corrisponda precisamente alla struttura reale che viene esaminata. L’analisi computerizzata dell’immagine utile per ricostruire oggetti tridimensionali a partire da visioni oblique multiple. Tutti questi approcci stanno estendendo la risoluzione e il campo d’indagine della microscopia al punto che possiamo iniziare ad immaginare le strutture di singole macromolecole.

13. Preparazione Dei Campioni per l'Analisi Istologica Come si preparano sezioni istologiche per la microscopia ottica ed elettronica.

14. Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica • Acquisizionedel campione e taglio in pezzi (1cm3) • Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem. • Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi).

15. Fissaggiodel campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare) • generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide); • cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine; • si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli"; • deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi presenti degradino il tessuto.

16. Disidratazionedel campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo • Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O. • Eliminazionedell'etanolo e passaggi in xilene • Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

17. Inclusionedel campione in in mezzo appropriato paraffina o resina • Tessuti sono "molli" e fragili • Diversi passaggi in paraffina calda • La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O • La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione