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Evaluation comparative de la MRD de LAL

Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) ( N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR compétitive) (H.Cave, Hôpital Robert Debré, Paris). CMF: 151 patients (345 prélèvements) PCR: 120 patients (202 prélèvements).

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Evaluation comparative de la MRD de LAL

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  1. Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire(PCR/IgH-TCR compétitive) (H.Cave, Hôpital Robert Debré, Paris) • CMF: 151 patients (345 prélèvements) • PCR: 120 patients (202 prélèvements) • Nantes: 128 patients (300 prélèvements) • Patients consécutifs, non sélectionnés • Extérieurs: 23 patients (45 prélèvements) (7 centres) • Patients testés en CMF car PCR problématique • N.Nés: 14 cas, Enfants: 127 cas, Adultes: 10 cas 1 aout 2007

  2. marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL B (Nantes; dg: 2000-2007)(n= 225) nombre de LAP pour MRD (n= 112) 1 aout 2007

  3. #1 Hématones #2 LAL-B-CD10+ #3 LAL-B-CD10+ Gate: CD19+ 99% 95% CD38-PE 99% 5% 99% 99% CD58-PE 99% 0% CD123-PE 90% 95% 99% CD10-FITC 1 aout 2007

  4. marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL T (Nantes+ext.; dg: 2003-2007)(n= 43) 1 aout 2007

  5. Ly (CD45++) Blastes T (CD45+interm.) 92% CD99-PE 72% cCD3-APC 79% cCD3-APC 98% CLO Fab LALTIII CD3- TdT-FITC 1 aout 2007

  6. Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-B de l ’enfant • 3(4) Ac.Mo. Constants, conjugués APC, PerCP & FITC • CD19APC – CD45perCP – CD10FITC* • (* si LAL-B CD10-: ajout du CD20FITC) • 4e Ac.Mo. Variable, conjugué PE • contrôlePE • CD20PE /CD34PE / CD38PE / CD58PE / CD123PE • CD11a / CD21PE / CD22PE / CD24PE / CD79bPE • CD2PE / CD4PE / CD5PE • CD13PE / CD33PE / CD36PE / CD117PE Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 96% des prélèvements 1 aout 2007

  7. Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-T de l ’enfant • LAL-T CD3- • cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-contrôlefitc • cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-TdTfitc • cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-contrôlepe • cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD99pe • cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD34pe • cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD1ape • cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD10pe • cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD13/33/117pe • LAL-T CD3+ • Combinaisons « à la carte ». Incluant, par exemple: • CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, TdT, CD56, CD99, Tgd… Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 76 / 85 (90%) des prélèvements 1 aout 2007

  8. Méthode* • Marquage à 4 couleurs (PerCP, APC, PE, FITC) • (FACScalibur, BD, USA) • En acquisition sélective (« live-gating »): • - des cellules CD19+totales si LALB • - des cellules cCD3+ totales si LALT CD3- ou CD3+ totales si LALT CD3+ • Puis quantification par fenêtrages successifs des cellules leucémiques *Selon Campana D, Constan-Smith E, Cytometry 38:139, 1999 1 aout 2007

  9. 1e étape: exemple d’une LAL-B CD10+ • Réglages et compensations • Traçage de la fenêtre de sélection (live gate) CD19+ • Calcul du % de cellules B (hors débris) 95% 2,3% 10.000 évènements cell. B totales (R1xR2): 2,2% cell. Nuclées totales 1 aout 2007

  10. 2e étape:exemple d’une LAL-B CD10+ avec MRD négative • sélection des cell. B totales du tube (live gate CD19+) puis repérage et comptage des blastes leucémiques par multi-fenêtrage 22.000 évènements sélectionnés (/ 106 cell.) Hématogones CD10+CD38++CD45+/++ 2,1% cellules totales Blastes leucémiques CD10+CD38+CD45- <0,01% cellules totales Blastes leucémiques (MRD)= %Btot.x (R2xR3xR4xR6)= 2,2% x 0,00% (<20 events)= 0% => MRD-LAL=  <0,01% (seuil de sensibilité maxi.) R6 1 aout 2007

  11. LAL-B CD10+ testée avec 6 combinaisons (+ 1 contrôle) Blastes leuc. : 76,3% des cell.B tot (Phénotype: CD10++ CD13+ CD20- CD22+ CD34++ CD38+ CD45-/+ CD58+) MRD: 0,58% cellules totales 10++fort 10++fort 10++fort MRD MRD 34++ homogène 38+faible MRD 10++fort 10++fort MRD MRD MRD 10+ MRD 45+faible

  12. MRD LAL - Faisabilité * Patients consécutifs, non sélectionnés ** Patients testés en CMF pour MRD problématique en PCR 1 aout 2007

  13. MRD LAL - Faisabilité selon le type immunologique* *p<0.001 Patients de Nantes (consécutifs, non sélectionnés), uniquement 1 aout 2007

  14. MRD LAL - Faisabilité Cause des échecs de la détermination de la MRD en CMF (9 prélèv.(3%); 6 patients (4%)) MRD ok en PCR-IG/TCR: 7 / 9 (78%) prélèvements 1 aout 2007

  15. MRD LAL - Faisabilité de la CMF en cas de PCR IGH/TCR problématique *surface T-cell receptor (CD3/Tab/Tgd) 1 aout 2007

  16. MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le type immunologique - nombre de prélèvements= 328/337 (97%)* - *prélèvements inévaluables en CMF exclus – n= 9 (3%) **comparaison MRD <0,1% LALT v LALB (tout type) p=0,03 (X2 test) 1 aout 2007

  17. MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le point de suivi (nombre de prélèvements= 342*) *prélèvements inévaluables en CMF exclus, **biaisés (fait en cas de pb clinique ou de cyto) ***comparaison MRD1 v MRD2: p=0.01 (X2 test) 1 aout 2007

  18. MRD LAL - Fiabilité de la CMF Comparaison des résultats de MRD des prélèvements étudiés en PCR IGH/TCR et en CMF parallèlement (tandem study) (nombre de prélèvements évaluables= 165) 1 aout 2007

  19. Conclusions • Excellente concordance des résultats de MRD en CMF-4 couleurs et PCR IGH-TCR compétitive (94%) • En cas de discordance, le niveau de MRD en CMF est généralement plus faible qu’en PCR • Applicabilité de la CMF supérieure à celle de la PCR (95% versus 87%), particulièrement pour les LAL-B CD10- et les LAL-T immatures • CMF-4 couleurs plus rapide, plus simple (et moins coûteuse?) que la PCR quantitative • mais fiabilité des résultats dépendant du nombre et, surtout de la qualité (sensibilité et stabilité) des marq. leucémiques testés, tant en CMF, qu’en PCR • limites de la CMF: Qualité des prélèv. (viabilité cellulaire++) & Reproductibilité inter-labo. de la CMF?

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