CA García Sepúlveda MD PhD

1. Pharmacogenomics & Pharmacogenetics CA García Sepúlveda MD PhD Laboratorio de Genómica Viral y HumanaFacultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

2. Variaciones Farmacológicas • Farmacoterapia idealmente debería inducir el mismo efecto sobre todos los individuos a los cuales se administra. • Variaciones inter/intraindividuales: • Farmacocinéticas: Diferentes concentraciones en sitio de acción. • Farmacodinámicas: Diferente respuesta a una misma concentración. Variación generalmente cuantitativa (mayor/menor efecto o duración) con poca variación cualitativa. Las variaciones cualitativas (efectos diferentes) corresponden a reacciones idiosincráticas determinadas por rasgos inmunológicos o genéticos.

3. Variaciones Farmacológicas En los EEUUAA, más de 2 millones de individuos son hospitalizados anualmente con motivo de reacciones adversas a fármacos. De esos 2 millones, aproximadamente 100,000 mueren como consecuencia de esas reacciones adversas, convirtiendolas en la SEXTA causa de muerte por el número de personas que afecta.

4. Variaciones Farmacológicas • Factores responsables de la variación en la respuesta a fármacos: • Etnia • Edad • Embarazo • Factores genéticos • Reacciones idiosincráticas • Patologías • Interacciones farmacológicas

5. Factores Genéticos • Gran parte de la variabilidad individual está determinada genéticamente. • Procariotas = Acercamiento minimalista/simplista a la vida. • Eucariotas = Acercamiento innovador a la vida (promueve la evolución). • La vida media de la Warfarina (anticoagulante oral) y del Antipireno (marcador de • oxidación hepática) es 6 - 22 veces más variable entre individuos geneticamente • diferentes que entre individuos genéticamente idénticos (gemelos idénticos).

6. Factores Genéticos Los genes (algunos) codifican para proteinas (4 nucleótidos = 22-24 aminoácidos) Mutación = Cambio en la secuencia de DNA. Algunos cambios en la secuencia de DNA producen cambios de la proteina codificada. La mayor parte de los cambios proteicos no son bien tolerados por que disminuyen la viabilidad del portador. SELECCIÓN NEGATIVA Una mutación común del gen G6PD condiciona una mayor susceptibilidad a la hemólisis por estrés oxidativo, esto es PERJUDICIAL. La misma mutación (homocigota) del gen G6PD condiciona una mayor resistencia a formas severas de Malaria confiriendo una ventaja para individuos que viven en regiones endémicas. Esto es VENTAJOSO.

7. Factores Genéticos Cuando los cambios de la secuencia de DNA son perjudiciales suele llamárseles mutaciones y suelen ser seleccionados negativamente (eliminados). Cuando los cambios de la secuencia de DNA son benéficos suelen ser tolerados y logran infiltrar a la población (fijación). Las mutaciones que se han fijado en la población se denominan polimorfismos. Los polimorfismos pueden ser tan comunes que llegan a un equilibrio por encontrarse a la misma frecuencia que el rasgo Wild-type. El término Wild-Type pierde significado o importancia.

8. Factores Genéticos La raza humana ha acumulado tantas mutaciones a lo largo de su evolución que es posible distinguir entre individuos cercanamente relacionados a través de ellos. A estas mutaciones aisladas se les denomina Single Nucleotide Polymorphisms (Polimorfismos de nucleótidos aislados) o SNPs.

9. Factores Genéticos Los SNPs son mejor conocidos por su fama televisiva

10. Factores Genéticos • Algunos SNPs se ubican en genes involucrados directa o indirectamente en la acción de fármacos. • Receptores • Enzimas • Transportadores • Etc • Estos polimorfismos pueden afectar la predisposición individual a desarrollar reacciones adversas (o a responder) a los fármacos. • Teoricamente es posible tomar el DNA de una persona, tamizar la presencia de estos polimorfismos farmacologicos y extender recomendaciones terapéuticas (ajustes de dosis, selección del agente ideal, etc) MEDICINA INDIVIDUALIZADA. • Ejemplos de polimorfismos que afecta la respuesta farmacológica.

11. Número de sujetos Farmacogenética de la Isoniacida Algunas horas después de la adminisración de salicilato la concentración plasmática de un grupo representativo de la población humana muestra una distribución Gausiana alrededor de los 250 ± 150 umol/L. La mayor parte de los individuos tratados responderan de manera relativamente similar. 0 100 200 300 400 umol/L

12. Número de sujetos Farmacogenética de la Isoniacida Las concentraciones plasmáticas de la Isoniacida presentan distribución bimodal. 50% de a población logra bajas conecntraciones por acetilar rápidamente a la Isoniacida. 50% restante acetila lentamente la Isoniacida lo que permite que el fármaco se acumule en sangre y aumente su concentración plasmática media. 0 10 20 30 40 50 60 umol/L

13. Número de sujetos Farmacogenética de la Isoniacida El ejemplo demuestra el carácter cuantitativo (concentraciones) condicionado por dicho polimorfismo. No obstante, también hay un efecto cualitativo relacionado con su toxicidad. 0 10 20 30 40 50 60 umol/L • Neuropatía periférica • Mediada directamente por la Isoniacida • Más común en los acetiladores lentos • Hepatotoxicidad • Mediada por metabolito acetilado de Isoniacida (Acetilhidracina) • Más común en los acetiladores rápidos

14. Farmacogenética y Citocromo P450 Citocromo P450 alias CYP, P450 y ocasionalmente CYP450. Superfamilia de hemoproteinas involucradas en cadenas de transporte de electrones. Proteinas celulares con absorbancia espectrofotométrica carácterística a los 450 nm. Asociadas a membranas (mitocondriones y RER). Capaces de metabolizar a una gran diversidad de sustratos. Son las principales enzimas involucradas en el metabolismo de fármacos (ca 75% del metabolismo farmacológico neto). 7700 genes CYP descritos en ambos reinos abarcando desde archaea hasta humanos. 57 genes en humanos agrupados en 18 familias y 43 subfamilias.

15. Farmacogenética y Citocromo P450 57 genes en humanos agrupados en 18 familias y 43 subfamilias. El efecto de los polimorfismos sobre la actividad catalítica ha sido descrito para tres isoformas: CYP2C9, CYP2C19 & CYP2D6 Estas tres isoformas responsables del 40% de la oxidación farmacológica mediada por CYP. CYP2D6 la más estudiada, implicada en el metabolismo de: • Antagonistas -adrenérgicos • Antiarrítmicos • Opioides • Farmacos con actividad en SNC CYP2D6 posee más de 80 variantes alélicas (variaciones del mismo gen).

16. Farmacogenética y Citocromo P450 Algunos alelos poseen mutaciones/polimorfismos que afectan la función de la enzima codificada disminuyendo o anulando su actividad. Metabolismo lento de farmacos mencionados. Algunos individuos poseen combinaciones de alelos (haplotipos) que les confieren mayor actividad enzimática. Metabolismo ultrarrápido de farmacos mencionados. Cabe mencionar que el metabolismo mediado por CYP450 no siempre inactiva a los fármacos, en el caso de algunos profármacos (codeina) la enzima participa en su activación en vez de desactivación.

17. Farmacogenética y Suxametonio Un ejemplo bien estudiado del efecto de las variaciones genéticas sobre las tasas de metabolismo farmacológico. Alias Cloruro de Suxametonio, Succinilcolina, scolina o coloquialmente como Sux. Bloqueador neuromuscular despolarizante de uso extenso en medicina de emergencia y anestesia para lograr la relajación muscular (usualmente para intubación endotraqueal) por su acción corta. Metabolizado por colinesterasa plasmática (butirilcolinesterasa). 1:3,000 no son capaces de degradarlo rápidamente debido a un gen recesivo codificante para una colinesterasa plasmática anómala incapaz de eliminarlo. No obstante, hay otras razones no genéticas que pudieran condicionar el bloqueo neuromuscular prolongado por lo cual el estudio genético brindaría información.

18. Reacciones Idiosincráticas Definición: Un efecto cualitativamente anómalo y generalmente perjudicial de un fármaco, que aparece en una pequeña proporción de la población usualmente por causas aun no conocidas. Cloramfenicol Antimicrobiano bacteriostático Aislado de la bacteria Streptomyces venezuelae, 1949. Primer antibiótico manufacturado sintéticamente a gran escala Amplio espectro Reacción idiosincrática ocasiona Anemia Aplásica en 1:50,000 Primaquina, Doxorrubicina, Dapsona, Sulfamidas, Habas o inhalación del polen (Favismo) Anemia hemolítica aguda severa 5-10% afro-caribeños

19. Deficiencia de G6PD Enfermedad genética hereditaria recesiva ligada al X. Niveles anormalmente bajos de Glucosa 6-Fosfato Deshidrogenasa. Enzima metabólica involucrada en via de pentosas, crítica para eritrocitos. La G6PD permite a los eritros mantener al Glutation en estado reducido (GSH). El GSH es necesario para evitar la hemólisis de los eritrocitos. La Primaquinaet al disminuye los niveles de GSH eritrocitarios sin repercusiones en individuos normals pero no en los G6PD-deficientes. Los individuos heterocigotos (♀) presentan una alta resistencia a desarrollar formas grave de Malaria (ventaja selectiva). Individuos generalmente asintomáticos, sintomáticos generalmente ♂. Debut clínico: ictericia RN y kernícterus, crisis hemolíticas (fármacos, dieta, infecciones), Insuficiencia Renal Aguda, Favismo.

20. Porfirias hepáticas • Otro ejemplo prototípico de enfermedades farmacogenéticas. • Grupo de patologías hereditarias raras que afectan a ciertas enzimas involucradas en la biosíntesis de proteinas hemo. • La deficiencia de estas enzimas lleva a la acumulación de precursores biosintéticos (principalmente de porfirinas). • En episodios agudos hay síntomas GI y neurológicos (alteraciones del comportamiento). • Varios fármacos pueden precipitar crisis al inducir la actividad de la Acido -Amino Levulinico-Sintasa (ALA-sintasa) hepática: • Barbitúricos • Griseofulvina • Carbamacepina y • Estrógenos • Las porfirinas se sintetizan a partir del ALA. Bisclavret George III

21. Farmacogenómica La farmacogenética es una disciplina aplicada hoy en día, la farmacogenómica continua siendo un ideal por alcanzar.

22. Farmacogenómica • Mientras que la farmacogenética se enfrenta a evaluar la manera en que genes individuales afectan las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas la farmacogenómica contempla la influencia del genoma completo con la intención de individualizar la terapéutica médica al contexto genético del paciente. • La farmacogenómica promete: • Identificar las variaciones genéticas que afectan la respuesta a fármacos. • Identificar los genes asociados a enfermedades que puedan servir de blanco (diana) para acercamientos terapéuticos futuros. • Identificar las variaciones genéticas que condicionan reacciones adversas.

23. Farmacogenómica Identificación de variaciones genéticas que afectan la respuesta a fármacos.

24. Farmacogenómica y Warfarina • La warfarina es un anticoagulante oral que inhibe a la reductasa de Vitamina K. • La reductasa de vitamina K es la responsable de reducir a la vitamina K oxidada. • Descubierta hace 60 años y uno de los fármacos más prescritos en el mundo. • Empleada para prevenir y tratar tromboembolismos: • FA • Infarto recurrente • TVP • TEP • Prótesis valvulares

25. Farmacogenómica y Warfarina Tendencias de prescripción médica: a la alza (1.5 x o 45% en los últimos 6 años).

26. Farmacogenómica y Warfarina El principal riesgo asociado a su uso es el del sangrado lo cual suele ser frecuente y severo. Entre 1 y 7 pacientes de cada 100 tratados sufrirá un episodio de sangrado crítico que lo ponga en riesgo de muerte. Riesgo relativo de sangrados fatales extracraniales de 0 a 5 %. Indice terapéutico estrecho. Polimorfismos de CYP2C9 & VKORC1 determinan metabolismo Ls polimorfismos de VKORC1 posiblemente expliquen el 25% de las variaciones interindividuales en las respuestas a warfarina. Los portadores de estos polimorfismos se encuentran en mayor riesgo de responder de manera exagerada al anticoagulante. Por otro lado polimorfismos de CYP2C9 explican un 10% de las variaciones interindividuales disminuyendo el tiempo en que se logra el margen terapéutico.

27. Farmacogenómica y Warfarina La FDA menciona en la etiqueta del Coumadin: “The Food and Drug Administration highlights the opportunity for healthcare providers to use genetic tests (CYP2C9 & VKORC1) to improve their initial estimate of what is a reasonable warfarin dose for individual patients”.

28. Terapia Génica • Definición: La alteración deliberada del fenotipo celular con intenciones terapéuticas o preventivas a través de: • La introducción de material genético. • La mutación in situ de secuencias de DNA • La disrupción de los productos génicos • Etica: Actualmente hay consenso internacional que limita las investigaciones terapéuticas a la manipulación de la línea somática sin alterar el DNA de la descendencia del paciente. • Reparación/manipuación somática = OK. • Reparación/manipulación germinal = No aprobada.

29. Terapia Génica • Alcances: ofrece el potencial de curar de forma radical enfermedades mongénicas como: • Fibrosis quística (deficiencia de -tripsia que altera al epitelio respiratorio). • Hemoglobinopatías (Talasemias). • SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency). • Hemofilia • Distrofia Muscular • Anemia falciforme

30. Terapia Génica • El 14 de Septiembre de 1990, W. French Anderson y Cols del US-NIH realizan primer procedimiento de terapia génica en niño de 4 años con SCID. • Procedimiento ex vivo en el cual leucocitos autólogos son modificados in vitro y reinfundidos. • Requiere de dosis sucesivas. • Dos acercamientos a la terapia génica: • In vivo • Ex vivo

31. Terapia Génica • Obstáculos por solventar: • Farmacocinética (“homing” del gen a células diana). • Expresión controlada del producto génico. • Eficacia clínica y viabilidad a largo plazo. • SEGURIDAD. • La manera en que son adminisrados los genes • correctivos se ha apoyado en lo mucho que hemos aprendido acerca de los mejores transmisores de información genética sobre el planeta: los virus. • Hipótesis del gen egoista y humanos DVD.

32. Terapia Génica • Mecanismos: • Inserción de gen normal para reemplazar uno anómalo. • Eliminación de genes anómalos sin reemplazo. • Reparación de genes anómalos empleando maquinaria celular. • Regulación del gen con función anómala.

33. Terapia Génica • Vectores de transporte: La elección del vector ideal depende del tamaño, tipo y complejidad del ácido nucleico por administrar. • Virales • Retrovirales • Adenovirales • Virus asociados a Adenovirus • Vectores virales con proteinas de superficie modificadas • No-virales • DNA desnudo (plásmidos) • Oligonucleótidos • Liposomas • Híbridos • Dendrímeros

34. Terapia Génica Virales Los virus han perfeccionado el arte de transferir información genética. Tropismo selectivo: Adeno = Epitelio respiratorio Lenti = Linfocitos Secuestro de maquinaria celular. Algunos virus han adoptado mecanismso para integrar su material genético al genoma del hospedero (lentivirus y algunos Hepadnavirus).

35. Terapia Génica • Virales (Retrovirus) • Vector viral debe ser: • Seguro • Eficiente • Específico para tipo celular • Duradero • Expresión selectiva • Seguro • Retrovirus son altamente específicos, muy eficientes, ocasionan transfecciones duraderas (efecto limitado a vida media de célula infectada) pero poco seguros. • Seguridad depende de actividad retrotransposónica. • Actividad retrotransposición lo lleva a brincar dentro del • genoma humano al azar ocasionado daño al hacerlo.

36. Terapia Génica • Virales (Retrovirus) • Ensayos clínicos empleando vectores retrovirals para el tratamiento de SCID actualmente muy prometedores (deficiencia de ADA). • Más de 25 pacientes incorporados a ensayos en US, FR, DEU, IT, JAP y UK. • Constituye el ejemplo más exitoso de terapia génica hasta la fecha (gran éxito en la reconstitución inmune). • Ensayos americanos detenidos tras reportes de leucemia en pacientes de FR. • Leucemia resulta de mutagenesis insercional.

37. Terapia Génica • Virales (Adenovirus) • Muy eficientes. • Adenovirus son muy seguros. • Altamente selectivos. • Baratos • Faciles de armar. • Seguros (no integran) • Efecto temporal.

38. Terapia Génica No-virales (DNA Desnudo, oligonucleótidos, plásmidos y liposomas) Plásmidos constituyen material genómico procariota extracromosómico. Capaces de alcanzar el núcleo eucariota. Entre 1.5 y 15 kbp, largo de aprox 2uM. Poco eficiente. No hay riesgo de replicación viral. No son inmunógenos. No integra. No se puede dirigir específicamente a una diana celular.

39. Terapia Génica No-virales (DNA Desnudo, oligonucleótidos, plásmidos y liposomas) Particular interés en terapéutica tumoral. Vesículas bilipídicas entre 0.025 y 0.5 uM. Facil penetración de membranas celulares. Pocas barreras tisulares. Atraviesan barrera hematoencefálica. Empleadas para transfección de HLA e IL-2. No inmunógenas (a menos de que posean proteinas de membrana).

40. Terapia Génica Dendrímeros Macromolécula ramificada esférica de alto peso molecular. Compartamentalización de superficie permite transportar fármacos (genes). Transporte de RNA o DNA (terapia génica temporal vs duradera, respectivamente). Incorporado a la célula por interacciones electrostáticas con membrana y a través de endocitosis. Algunas células no pueden ser transfectadas por ellos. Se ha reportado toxcidad asociada a propiedades catiónicas. Acercamiento no económico, lento y especializado. Michigan based company Dendritic "Priostar" Nanotechnology.