Методы ЛАЛ-теста

1. Методы ЛАЛ-теста Часть 3

2. Гель-тромб Полуколичественный гель-тромб Хромогенный Турбидиметрический Кинетический хромогенный Кинетический турбидиметрический Признанные методы ЛАЛ-теста

3. У каждого метода есть свои преимущества Выбор метода зависит от: Требуемого результата количественный полуколичественный Имеющегося в наличии оборудования Типа образца Какой метод лучше?

4. У каждого метода свое назначение Для выбора метода необходимо оценить тип и объемы тестирования В некоторых случаях имеет смысл применять более одного метода, например, для тестирования воды – кинетическийхромогенный и кинетический турбидиметрический Выбор метода

5. Механизм реакции Образование геля итурбидиметрический тип ИЛИ Хромогенный тип

6. Гель-тромб метод Механизм и суть метода

7. Лизат амебоцитов Limulus Гель-тромбметод Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Свертывающийся белок +(фрагмент) Коагулянт Свертывающийся белок Электростатические связи Образование геля

8. Постановка гель-тромб теста Шаг за шагом

9. Подготовка образцов и правильное разведение, дозирование в пробирки

10. Приготовьте стандарт или серии стандартов и дозируйте в пробирки

11. Добавьте положительные контроли

12. Восстановите ЛАЛ-реактив ЛАЛ-реагентной водой

13. Добавьте лизат в пробирки для постановки реакции

14. Поместите в инкубатор на 60 минут

15. Гель-тромб (Положительный) Медленно переверните пробирку

16. Очень простой тест Результат интерпретируется субъективноСледовательно, результат зависит от лаборанта Метод считается недорогим, однако все зависит от количества образцов Наиболее доступный метод по начальным инвестициям Интерпретация результатов гель-тромб теста

17. Результаты считываются на-глаз после переворачивания пробирки вручную На образование геля влияют различные факторы вибрация pH температура другие белки Трудоемкий метод для средних и больших партий Трудоемкий для валидации продукта метод Возможные проблемы гель-тромб метода

18. Пример гель-тромб метода для подтверждения заявленной чувствительности лизата Образец Заявленная чувствительность лизата=0.125 ЕЭ/мл Допуск 0.25 ЕЭ/млдо 0.06 ЕЭ/мл 0.5 0.25 0.125 0.062 0.031 1 2 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + Ср. геометрическое =Antilog ( 1 x Log (0.125) + 3 x Log (0.062)) /4

19. Два вида гель-тромб метода предел Полуколичественный Предел Дает ответ ДА/НЕТ при определенной чувствительности реактива Полуколичественный Можно определить концентрацию эндотоксина в образце путем серии разведений Виды гель-тромб метода

20. Методы конечной точки Механизм и суть метода

21. Теоретически существует два метода Хромогенный метод конечной точки Турбидиметрический метод конечной точки На практике применяется только хромогенный метод конечной точки Методы конечной точки

22. Первый разработанный количественный метод Диапазон чувствительности зависит от времени инкубирования Типичный диапазон: 1.0 ЕЭ/мл до 0.1 ЕЭ/мл Расширенный диапазон:0.1 ЕЭ/млдо 0.01 ЕЭ/мл Линейная зависимость от уровня эндотоксинов Пониженная чувствительность к интерферентным факторам благодаря применению хромогенного субстрата Хромогенный метод конечной точки

23. Замещение хромогенным субстратом коагулянта

24. Постановка хромогенного теста конечной точки Шаг за шагом

25. Дозируйте стандарт и образец

26. Добавьте 50 ллизата и инкубируйте

27. Добавьте 100лсубстрата и инкубируйте

28. Добавьте 100 лреактива для остановки реакции

29. Результаты считываются через 405 нм фильтр

30. Требует многоразового добавления реактивов Добавить лизат в стандарт и образец и инкубировать Добавить субстрат и инкубировать Добавить реактив для остановки реакции (10% уксусная кислота или 10% SDS) Считывание результатов на волне 405 нм Соответствие температуры инкубации (37oC) является критичным фактором Характеристики хромогенного метода конечной точки

31. ЛАЛ тест хромогенный конечной точки Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Высвобождение PNA +(фрагмент) Хромогенный субстрат Концентрации эндотоксина Концентрация PNA (Желтый цвет) Прямая зависимость от

32. Коэффициент корреляции (R2) = 0.9987 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 OD Linear (OD ) Хромогенный тест конечной точки

33. Дает количественный результат, интерпретация результатов объективная, результаты стабильны в течение 30 мин Хромогенный субстрат снижает влияние интерферентных факторов Трудоемкий процесс, в ходе которого возможны ошибки оператора Процесс можно автоматизировать Оценка хромогенного теста конечной точки

34. Короткое время инкубирования обусловливает сложность поддержания равномерности поддержания температуры микропланшет Узкий диапазон может требовать дополнительных разведений для получения результатов Трудоемкий метод Реагент для остановки реакции может вызвать выпадение осадка Возможные проблемы хромогенного метода конечной точки

35. Кинетические методы Механизм и суть методов

36. Наиболее недавние методы Наиболее объективные методы Два вида кинетических методов Кинетический турбидиметрический Кинетический хромогенный Кинетические методы

37. Первый из разработанных кинетических методов Широкий стандартный диапазон 10.0-0.01 ЕЭ/мл Первые методики были неточными на всем диапазоне измерений Современные реактивы дают меньшую погрешность Кинетический турбидиметрический метод

38. Добавление реактива только один раз Добавить реактив в стандарт Добавить положительные контроли продукта (обычно по 10 mл) Подогрейте планшет Добавьте лизат и начните тест Определите результаты Микропланшеты также требуют обработки в шейкере Кинетический турбидиметрический метод

39. Кинетический турбидиметрический ЛАЛ-метод Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Свертывающийся белок +(фрагмент) Коагулянт Образование мутности Свертывающийся белок Электростатические связи

40. Более быстрый метод, чем количественный конечной точки Широкий диапазон Очень хорошо подходит для тестирования воды, но могут быть сложности с концентрированными сложными продуктами Менее дорогостоящие реагенты, чем для кинетического хромогенного метода Менее стабильный в процессе исполнения метод, чем кинетический хромогенный метод Кинетический турбидиметрический метод

41. Слабое отношение сигнал-шум, наличие пузырьков могут затруднять анализ Влияние таких же интерферентных факторов как и для гель-тромб теста: вибрация pH температура другие белки Наличие пузырьков может затруднить анализ Не подходит для вязких и мутных продуктов Кинетический турбидиметрический метод – возможные трудности

42. Наиболее поздний из кинетических методов вследствие трудности создания комбинированного реактива Лизат и синтетический субстрат Отличное отношение сигнал-шум по сравнению с турбидиметрическим методом Кинетический хромогенный - Delta OD 200 milliOD Кинетический турбидиметрический - Delta OD 30 milliOD Менее подвержен влиянию интерферентных факторов Кинетический хромогенный метод

43. Широкий стандартный диапазон До 4 log диапазона (50-0.005 ЕЭ/мл) Реактив добавляется один раз, что минимизирует вероятность ошибки оператора Применение синтетического субстрата облегчает валидацию комплексных продуктов Позволяет анализировать мутные и вязкие образцы Кинетический хромогенный метод

44. Проведение кинетического хромогенного метода Шаг за шагом

45. Дозируйте стандарты и образцы

46. Добавьте положительный контроль продукта (ПКП) Pre-warm the Plate in the incubating reader for 10 minutes

47. Добавьте лизат и начните анализ

48. Планшет инкубируется, показания считываются каждые 150 секунд

49. Готовый анализ Примечание: KQCL легко справляется с сильно окрашенными образцами, например, метиленовый синий

50. Реагент добавляется только один раз Дозируйте стандарты и образцы Добавьте положительный контроль продукта (как правило по 10 mл) Подогрейте планшет Добавьте лизат и начните анализ Collect Results Микропланшеты также требуют обработки в шейкере Кинетический хромогенный метод