Informe sobre la elaboración de la maqueta de Biocombustibles de cuarta generación

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA BIOCOMBUSTIBLES DE CUARTA GENERACIÓN BIOTECNOLOGIA DOCENTE: Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales ALUMNA: Adriana Khristal Viglanzoni Mendoza CICLO: VII

2. Tabla de contenido Tabla de contenido 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 3 2. OBJETIVO .................................................................................................................................. 4 3. MARCO TEORICO .................................................................................................................... 4 3.1. SCENEDESMUS ALMERIENSIS ..................................................................................... 4 3.2. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ............................................................................. 5 3.3. BIOREACTOR TUBULAR ............................................................................................... 5 3.4. HIGROMICINA.................................................................................................................. 6 3.5. CEFOTAXIMA ................................................................................................................... 6 4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 6 5. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 9 2

3. 1.INTRODUCCIÓN El progresivo agotamiento de las reservas de combustibles fósiles está promoviendo la búsqueda de fuentes alternativas renovables, donde el biodiesel se presenta como una de las alternativas para cubrir esa demanda; pero su alto costo de producción, plantea otro grave problema, por lo que los investigadores se propusieron un reto en conseguir métodos de rutina para transformar genéticamente microalgas industrialmente prometedoras. Los biocombustibles que se conocen como de cuarta generación, resultan del uso de organismos genéticamente modificados, entre ellos microalgas, donde todos los procesos se llevan a cabo dentro de célula y como resultado excreta los productos deseados evitando los costosos procesos de extracción, fermentación o transformaciones químicas necesarias en las generaciones anteriores de biocombustibles. Evidentemente, como toda nueva tecnología que se encuentra en estado emergente, presenta aún muchos retos tecnológicos por resolver (Agustín, 2012). La elaboración de la maqueta, es basada en el paper “Microalgas para biodiesel: desarrollo de un método de transformación genética para Scenedemus almeriensis, una especie con potencial industrial” que tiene como autores a: Yasmeen Dautor, Tarik Chileh, Patricia Úbeda Mínguez, Aurora Mañas Fernández, Federico García Maroto y Diego López Alonso (Y. Dautor et al., 2013). La investigación plantea a Scenedesmus almeriensis, que es una especie de alga verde de agua dulce, procedente de charcos de desecación de invernaderos; la cual fue aislada por el grupo del Dr. Molina Grima del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería. 3

4. 2.OBJETIVO Elaborar una maqueta de biocombustibles de cuarta generación, basada en métodos de rutina para transformar genéticamente microalgas industrialmente prometedoras. 3.MARCO TEORICO 3.1. SCENEDESMUS ALMERIENSIS La especie con la que se ha trabajado ha sido S. almeriensis CCAP 276/24, perteneciente a la Clase Chlorophyceae (vulgarmente denominada algas verdes), Orden Sphaeropleales, y Familia Scenedesmaceae. Esta especie de agua dulce fue aislada por miembros del grupo de investigación “Biotecnología de Microalgas Marinas” del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería. Fue identificada, descrita y caracterizada como una especie nueva y patentada para diversos usos (patente WO/20067087405, Fernández Sevilla et al. 2006). Ilustración 1. Scenedesmus Almeriensis. Entre las ventajas de esta especie tenemos su elevada productividad de aceite, capaz de producir anualmente unos 20.000 L/ha, superando la especie vegetal más productiva en aceite que es la palma; otra de sus ventajas es que no demanda agua de riego, por lo que pueden 4

5. crecer en aguas no útiles para la agricultura, en aguas residuales, hasta en agua de mar (Y. Dautor et al., 2013). 3.2. AGROBACTERIUM TUMEFACIENS En este trabajo demuestra la utilización de la cepa LBA4404 (Hoekema et al. 1983) de A. tumefaciens, que es ampliamente usada en transformación genética de plantas en general, en la que en laboratorios tienen una amplia y acreditada experiencia. Ilustración 2. Agrobacterium Tumefaciens. 3.3. BIOREACTOR TUBULAR Los fotobiorreactores tubulares consisten esencialmente en tubos transparentes de vidrio o material plástico, conectados en serie o en paralelo para formar el colector solar, a través del cual se recircula la suspensión celular. Los tubos pueden estar dispuestos en horizontal (Molina Grima et al., 2001), en vertical (Converti et al., 2006), formando una espiral (Acién- Fernández et al., 2003), o inclinados (Vunjak-Novakovic et al., 2005). El diseño del reactor debe tener en cuenta el flujo idóneo y el adecuado intercambio gaseoso, además de maximizar la captura de luz, a la vez que se minimiza la ocupación de superficie. El diámetro del tubo 5

6. debe estar entre 2 y 15 cm, siendo el valor óptimo de aproximadamente 10 cm. El tamaño de la unidad de este tipo de reactor no debería sobrepasar los 5.000 l. (García Cubero, 2011). 3.4. HIGROMICINA Es usado universalmente para la selección, tanto de células eucariotas como de procariotas, transformadas con el gen higromicina fosfotransferasa II (hptII) que confiere resistencia frente a la Hyg (HygR). Para determinar la resistencia/sensibilidad de S. almeriensis a la higromicina, se sembraron en placas con medio TAP sólido con cantidades crecientes del antibiótico: 0, 2, 5, 10, 25, 50, y 100 mg/L. Para cada concentración del antibiótico se sembró 4 placas y se dejó crecer las microalgas hasta que aparecieron colonias bien visibles (Y. Y. Dautor, 2014). 3.5. CEFOTAXIMA La cefotaxima se utiliza en transformación genética mediada por A. tumefaciens rutinariamente en los medios selectivos después del co-cultivo para eliminar las bacterias (A. tumefaciens) cuando ya no son necesarias ni convenientes. Por consiguiente, también tuvieron que determinar la sensibilidad de la microalga frente a la cefotaxima (Y. Y. Dautor, 2014). 4.MATERIALES Y MÉTODOS El proceso de transformación genética comenzó con el cultivo en TAP (Tris-acetato- fosfato) en líquido, que es un medio de rutina para algas verdes de agua dulce; se procedió a la siembra de Scenedesmus almeriensis en una serie de placas, estas se cultivan en un medio comercial denominado agar nutritivo a Ph 8, con un fotoperiodo de 18 horas de luz y 6 de 6

7. oscuridad, a una temperatura de 26°, teniendo como resultado una especie de césped de microalgas. Aparte, con la antelación suficiente, se cultiva el Agrobacterium tumefaciens para tenerlo listo en el momento en que sea necesario. Ilustración 3. Ilustración 3. Esquema del proceso de transformación genética. Una vez que el césped verde de microalgas es bien patente, a cada placa de éstas se le añade una cierta cantidad del cultivo de Agrobacterium tumefaciens y se mezcla todo bien, a fin de propiciar el contacto entre las células de Scenedesmus almeriensis y las de Agrobacterium tumefaciens, se dejan de este modo en co-cultivo durante cierto periodo de tiempo. En este proceso se genera la transformación genética, que es llevado a cabo mediante 7

8. la Agrobacterium tumefaciens LBA4404, esta es una bacteria especializada en infectar células vegetales, mediante el vector de transformación plásmido Pcambia 1305.1, el cual se representa por los dos genes que contiene, uno es el “hpt” (que es un gen que genera resistencia a la higromicina) y el gen GUS como reportero (que codifica una proteína enzimática que puede dar una reacción coloreada), cada uno de ellos están flanqueados por sus respectivos promotores (35S) y señales de terminación (poly-A); en medio queda el sitio de clonación múltiple (MCS) y en los extremos los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) que delimitan el T-DNA, todo este segmento es transferido a la microalga. Ilustración 4. Organización del T-DNA del vector Pcamba 1305.1 Transcurrido este periodo, fueron cosechadas las células con medio líquido TAP conteniendo cefotaxima, que es un antibiótico que mata a Agrobacterium pero no afecta a Scenedesmus. Finalmente, se sembraron las células cosechadas en placas con medio selectivo conteniendo higromicina y se dejó crecer hasta que se vieron a simple vista colonias verdes. La determinación de las concentraciones óptimas de antibióticos para el método de transformación genética se hizo mediante un experimento factorial de 6x4 en el que se ensayaron las siguientes concentraciones: higromicina 0,10, 20, 30, 40 y 50 mg/L; cefotaxima 0, 250, 500, y 750 mg/L. 8

9. Como resultado de esta investigación se obtuvo alrededor de 700 clones transgénicos de Scenedesmus almeriensis en una sola ronda de transformación genética, por lo tanto, se puede concluir que se ha desarrollado un procedimiento de transformación genética eficiente para la microalga Scenedesmus almeriensis. Esta especie ya ha sido cultivada, ubicándose en las instalaciones de “Las Palmerillas” (Fundación CAJAMAR) situadas en La Mojonera (Almería) en reactores de 6.000 L, comprobando así que reúne todos los requisitos para poder convertirse en un microorganismo industrial, teniendo como producto final el biodiesel. 5.CONCLUSIONES La investigación refleja que se ha desarrollado con éxito un método de transformación genética para S. almeriensis, demostrando ser un método es sencillo, eficiente y fiable abriendo el camino para el desarrollo de la producción biotecnológica de substancias en una microalga industrialmente muy prometedora como es S. almeriensis. 9

10. 6.BIBLIOGRAFIA Agustín, J. (2012). Production of biofuels obtained from microalgae. Ra Ximhai, 8(Especial 3b), 101–115. https://www.redalyc.org/pdf/461/46125177011.pdf Dautor, Y., Chileh, T., Mínguez, P. Ú., Fernández, A. M., García-maroto, F., & López, D. (2013). Microalgas para biodiesel: desarrollo de un método de transformación genética para Scenedemus almeriensis, una especie con potencial industrial.17, 10–17. http://repositorio.ual.es/bitstream/handle/10835/3847/Chronica3_Lopez_Alonso.pdf?seq uence=1 Dautor, Y. Y. (2014). Tesis doctoral Microalgas modificadas genéticamente para producir biodiesel. García Cubero, R. (2011). Producción de biomasa de microalgas rica en carbohidratos acoplada a la eliminación fotosintética de CO2. Universidad de Sevilla, 136(3), 293–310. https://doi.org/10.1046/j.1529-8817.1998.340812.x Molina Grima, E., J. Fernández, A. F. G.,Y. Chisti (2001). "Tubular photobiorreactor desing for algal cultures." Journal of Biotechnology 2: 113-131. Acién Fernández, F. G., D. O. Hall, E. Cañizares Guerrero, K. Krishna Rao,E. Molina Grima (2003). "Outdoor production of Phaeodactylum tricornutum biomass in a helical reactor." Journal of biotechnology 103: 137-152. Converti, A., A. Lodi, A. Del Borghi,C. Solisio (2006). "Cultivation of Spirulina platensis in a combined airlift-tubular reactor system. ." Biochemical Engineering Journal 32: 13-18. Vunjak-Novakovic, G., Y. Kim, X. Wu, I. Berzin,J. C. Merchuk (2005). "Air-Lift Bioreactors for Algal Growth on Flue Gas: Mathematical Modeling and Pilot-Plant Studies." Ind. Eng. Chem. Res. 44(6154-6163). 10