Staphylococcus

1. Staphylococcus Dra. Elsa Masae Mamizuka USP Dr. Antônio Carlos Pignatari Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia - LEMC

2. Introdução a cocos Gram-positivos Características do Gênero Staphylococcus Staphylococcus aureus Enzimas Extracelulares Testes de aglutinação rápida para coagulase Padrões de Hemólise Regulação de Fatores de Virulência Staphylococcus epidermidis Outras espécies de Staphylococcus Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina Resistência aos Antibióticos Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina) Resistência à Vancomicina Detecção da VISA/VRSA Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma índice sair

3. Introdução a cocos Gram-positivos sair índice Os cocos Gram positivos (CG+) compõem um grupo de grande importância clínica. São responsáveis por inúmeras e variadas afecções e síndromes. Os CG+ anaeróbios facultativos de importância clínica pertencem a uma de duas famílias: Micrococcaceae ou Streptococcaceae Pesquisa de catalase na bactéria

4. catalase 2H2O + O2 2H2O2 Introdução a cocos Gram-positivos sair índice A partir da caracterização da amostra como CG+ através da coloração de Gram, a determinação da família é feita pela prova da catalase. A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio.

5. Introdução a cocos Gram-positivos sair índice - + Micrococcaceae Streptococcaceae As bactérias desta família são catalase NEGATIVAS As bactérias desta família são catalase POSITIVAS

6. Características do Gênero Staphylococcus sair índice Esta estrutura característica lembra cachos de uva.

7. Características do Gênero Staphylococcus sair índice As sp mais importantes na clínica S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis S. capitis S. schleiferi S. simulans S. warnei S. sciuri S. cohnii S. lentus S. xylosus S.saccharolyt. S. caseolyticus S. saprophyticus S. caprae S. gallinarium S. hominis S. hyicus S. chromogenes S. kloosii S. haemolyticus S. intermedius S. auricularis S. equorum S. delphini S. arlettae S. aureus

8. Características do Gênero Staphylococcus sair índice As mais importantes no laboratório clínico são: S. lugundensis S. carnosus S. epidermidis S. capitis S. schleiferi S. simulans S. warnei S. sciuri S. cohnii S. lentus S. xylosus S.saccharolyt. S. caseolyticus S. saprophyticus S. caprae S. gallinarium S. hominis S. hyicus S. chromogenes S. kloosii S. haemolyticus S. intermedius S. auricularis S. equorum S. delphini S. arlettae S. aureus

9. Staphylococcus aureus sair índice De todas as espécies do gênero, o S. aureus é o mais importante. É responsável pelo segundo maior número de infecções em seres humanos. O S.aureus está presente no trato respiratório superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da população em geral, e assim permanece sem causar doença em condições normais.

10. Características do Gênero Staphylococcus sair índice O gênero Staphylococcus é composto por várias espécies: S. carnosus S. epidermidis S. lugundensis S. simulans S. capitis S. schleiferi S. cohnii S. warnei S. sciuri S.saccharolyt. S. xylosus S. lentus S. caprae S. saprophyticus S. caseolyticus S. hominis S. gallinarium S. hyicus S. haemolyticus S. kloosii S. chromogenes S. auricularis S. equorum S. intermedius S. aureus S. delphini S. arlettae

11. Staphylococcus aureus sair índice O nome “aureus” significa “dourado” em latim, qualidade atribuída ao pigmento amarelado característico produzido pela bactéria.

12. Enzimas Extracelulares sair índice A enzima extracelular mais importante é a coagulase. A produção de coagulase é exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critério para a identificação de uma amostra como pertencente à espécie. coagulase Fibrinogênio Fibrina protrombina Estafilotrombina Causa coagulação Fatores de Virulência do Staphylos Staphylos não é o único que produz coagulase

13. Staphylococcus aureus sair índice No laboratório clínico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactéria em questão é inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espécie é S. aureus. Se não coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

14. Proteína A (SpA) Tem a habilidade de se ligar à porção FC de IgG, impedindo, portanto que ela sirva de fator de opsonização na fagocitose. Fab Fab IgG Fc SpA (Atn) S. aureus Staphylococcus aureus sair índice

15. Testes de aglutinação rápida para coagulase sair índice • Testa a presença de proteina A e fator de coagulação (clamping factor) • Fornece resultado + em 5 a 20 seg. • Mostra correlação de 80% com mét.classico • preço e mbalagem com 150un. U$116.00 • Teste de aglutinação do latex azul para detecção do clumping factor e protein A associado à Staphylococcus aureus • Resultado em 60 seg • Sensibilidade/especificidade: 99/92% • Inclui partícula de latex , cartão p/teste, haste, e controles positivo e negativo • Preço: embalagem de 105 um. U$ 105.62 • Validade 18 meses

16. Padrões de Hemólise sair índice esverdeado

17. Regulação de Fatores de Virulência sair índice Os fatores de virulência produzidos por S. aureus não são expressados a toda hora, são dependentes da fase de crescimento da bactéria. •  Proteína A •  adesinas •  coagulase •  hemolisinas • Toxinas  Alimento em abundância  alimento no de células Taxa estacionária  Proteína A  adesinas  coagulase  hemolisinas  toxinas tempo

18. Staphylococcus epidermidis sair índice A segunda espécie mais importante do gênero Staphylococcus é o Staphylococcusepidermidis. O Staphylococcusepidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores. Importante na infecção hospitalar

19. Staphylococcus epidermidis sair índice O Staphylococcusepidermidis é uma espécie bem menos virulenta do que S. aureus. Não apresentam a produção de coagulase e algumas cepas apresentam a produção muito tímida de certas enzimas proteolíticas. Todavia, isto não significa que S. epidermidis não possa ser patogênico. Esta espécie tem muitos fatores de adesão e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses, stents, etc.).

20. Staphylococcus epidermidis sair índice O Staphylococcusepidermidis é um risco para pacientes imunocomprometidos e para usuários de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infecções generalizadas não-piogênicas. Staphylococcusepidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infecções em locais com prótese.

21. Outras espécies de Staphylococcus sair índice No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.

22. Outras espécies de Staphylococcus sair índice No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.

23. Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica sair índice Gênero Catal. Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio Tétrade Estrito Staphylococcus + neg + neg não não Planococcus + + + neg + variável Micrococcus + neg + + variável variável Enterococcus neg variável + neg não não Streptococcus neg neg variável neg não não Aerococcus neg neg + neg não + Stomatococcus * variável neg neg neg não variável * aderente ao meio

24. Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus sair índice Coco GRAM + catalase Streptococcaceae - + Micrococcaceae Sensível à novobiocina? DNAse - + Staphylococcus sp. Coagulase + Staphylococcus não saprophyticus Staphylococcus aureus - + Staphylococcus grupo saprophyticus

25. Outras espécies de Staphylococcus sair índice No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua sensibilidade à novobiocina.

26. Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus sair índice Espécies de Staphylococcus do gruponão saprophyticus (Grupo epidermidis) Espécies de Staphylococcus do grupo saprophyticus S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. capitis S. warneri S. saprophyticus S. cohnii S. xylosus

27. Staphylococcus saprophyticus sair índice O Staphylococcussaprophyticus é de interesse clínico pois frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia. As outras espécies de Staphylococcus de interesse clínico causam infecções parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento é igual. Logo, o mais importante é discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa.

28. sair índice Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina

29. Resistência aos Antibióticos sair índice A primeira vez que um antibiótico foi usado, clinicamente, foi contra uma infecção por Staphylococcus aureus. Sir Alexander Fleming

30. Resistência aos Antibióticos sair índice A penicilina funcionou bem contra infecções estafilocócicas até os anos 60, quando rapidamente começaram a surgir cepas resistentes à penicilina.

31. Resistência aos Antibióticos sair índice Para contornar o problema, foi criado o beta-lactâmico sintético meticilina, que era resistente à ação das beta-lactamases. Anel b-lactâmico meticilina

32. Resistência aos Antibióticos sair índice A meticilina funcionou bem até os anos 70, quando começaram a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA). meticilina

33. Resistência aos Antibióticos sair índice Todo antibióticos beta-lactâmico se liga a enzimas que participam da síntese da parede celular chamadas PBPs (Proteínas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP é plenamente funcional mas não tem afinidade por beta-lactâmicos. penicilina PBP2a (PVN) ligadora de penicilina = enzima

34. Resistência aos Antibióticos sair índice Devido a este mecanismo de resistência, as cepas MRSA/ORSA são resistentes não só à penicilina, mas a todos os antibióticos beta-lactâmicos! No laboratório clínico, deve-se reportar num antibiograma resistência a todos os beta lactâmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas às vezes são suscetíveis = ocorre apenas “in vitro”) quando a amostra for MRSA mesmo quando são sensíveis a alguns beta lactâmicos in vitro. A PBP2a é codificada pelo gene mecA. Este gene é carreado num elemento genético móvel chamado de Cassete Cromossômico Estafilocócico mec (SCCmec).

35. Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA sair índice b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulação resistente.

36. Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina) sair índice Para detectar a resistência a oxacilina no laboratório clínico, pode-se utilizar a técnica de disco difusãoem ágar (Kirby-Bauer). Também pode-se detectar cepas MRSA através de um ágar screening de oxacilina que é ágar Müller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentração de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colônias indica resistência a oxacilina. Para a determinação da concentração inibitória mínima de oxacilina, o método de macrodiluição em caldo deve ser feito com caldo Müller-Hinton com uma concentração final de 4% de NaCl.

37. Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxacilina ( meticilina) sair índice O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina é uma alternativa válida em casos de dúvida, com uma eficácia diagnóstica praticamente similar ao do método de referência de dilução em ágar hiper salino, a concentração crítica de 6 µg/ml de oxacilina (NCCLS,1997). Sistemas automatizados de micro diluição nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficácia suficientes para a detecção deste tipo de cepas, quando comparado aos métodos de referência (Sánchez, 1998), Um método alternativo, rápido e eficaz, embora nem sempre aplicável em rotina, é a detecção do gene mecA, por métodos de amplificação por PCR (Murakami et al., 1991). Este método teria a vantagem de não estar sujeito às condições do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande número de isolados, empregado em casos de dúvida com valores de CIM próximo do limite.

38. sair índice

39. Resistência à Vancomicina sair índice O mecanismo de resistência à vancomicina em Staphylococcusaureus ainda não foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes. Em S. aureus, ocorrem fenômenos bizarros e pouco ortodoxos em relação à resistência à vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colônias de VRSA é heterogênea, dando a impressão de contaminação. VSSA VRSA VRSA

40. VSSA

41. VRSA

42. VRSA

43. Resistência aos Antibióticos sair índice Em 1997, foi relatada no Japão, a primeira cepa clínica de Staphylococcusaureus resistente à vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tóquio.

44. Resistência aos Antibióticos sair índice Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcusaureus resistentes à vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referência de queimados. Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001. ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu)

45. Resistência à Vancomicina sair índice Outro fenômeno comum à oxacilina e a vancomincina é a ocorrência da resistência heterogênea (hetero-resistência) de S. aureus a estes antibióticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo consideradas sensíveis por métodos tradicionais de avaliação sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas podem conter subpopulações de células que apresentam um MIC  8g/mL, numa freqüência de 1:106 células. Estas células não são detectadas por métodos tradicionais (antibiograma e MIC). A única forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA é através de uma análise de populações, onde se inocula diferentes diluições de uma suspensão bacteriana em meio de cultura sóilido adicionado de concentrações crescentes de vancomicina.

46. Resistência à Vancomicina sair índice Quando o resultado é plotado num gráfico obtém-se três possibilidades distintas de curva: VRSA hetero-VRSA VSSA Sensível à Vancomicina

47. Resistência à Vancomicina sair índice Observou-se também, por morfometria, que enquanto as cepas sensíveis à vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e VSSA

48. Resistência à Vancomicina sair índice Parece portanto, que a resistência à vancomicina está ligada a uma exacerbação da síntese da parede celular, em que inúmeros genes regulatórios estariam envolvidos. Até agora, todavia, ninguém parece saber por certo quais genes estão envolvidos e até que ponto. Uma das grandes limitações no estudo do mecanismo de resistência à vancomicina em S. aureus é que a emergência da resistência é um fenômeno ainda raro. Existem ainda poucas cepas no Mundo atualmente

49. Detecção da VISA/VRSA sair índice

50. Detecção da VISA/VRSA sair índice Pelo laboratório de referência