Métodos de identificação de biomoléculas e análise de proteínas

1. Métodos de identificação de biomoléculas e análise de proteínas

2. Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Semináriode Bioquímica SO2-T2 Elaborado por: Joana Abrantes Joana Couto João Costa João Pedro João Miranda João Barros João Gomes João Bernardes João Martins Coimbra, 07 de Outubro de 2009

3. Introdução 1º Passo Identificar: Indicar; Reconhecer; Sinalizar; Focar. 2º Passo Isolar a Biomolécula Estudar a sua avaliação funcional. 3º Passo Estudo das mesmas para o diagnóstico em Medicina.

4. Métodos de Identificação de Biomoléculas As biomoléculas são identificadas por: Químicas analíticas (espectroscopia de massa); Absorção/emissão/refracção da luz; Propriedades redox; Propriedades biológicas; Propriedades químicas; Propriedades físicas.

5. Alguns métodos de separação de Biomoléculas • Cromatografia; • Detergentes; • Centrifugação; • Absorvência; • Teste do Biureto; • Electroforese.

6. Cromatografia • Um dos métodos mais comuns de identificação de proteínas • Consiste na passagem de proteínas através de uma coluna (fase estacionária), destinada a reter/diminuir a velocidade de passagem dessas mesmas proteínas na fase móvel da coluna, de modo a serem devidamente separadas. • A coluna possui uma matriz/gel, que deverá estar embebido num líquido (tampão), usado para forçar o contacto entre a matriz e as proteínas a separar. • Utilizando este método, as proteínas podem ser separadas segundo: • carga (IEX – cromatografia de troca iónica) • hidrofobicidade (HIC – cromatografia de interacção hidrofóbica) • tamanho (GF – filtração em gel) • afinidade (cromatografia de afinidade) • Cuidados especiais: a solução a analisar deve ter a proteína concentrada e a execução do método deve ser rápida para evitar a degradação da mesma.

8. Absorvância Método utilizado na identificação de biomoléculas numa solução aquosa, permitindo calcular a sua concentração em determinada amostra. Definição: Aλ= -log10(I/I0) λ – comprimento de onda da radiação I – intensidade radiação incidente I0 – intensidade na radiação transmitida

9. Ultracentrifugação Com esta técnica podemos identificar parâmetros como a massa e densidade, aprender algo sobre a forma da biomolécula e investigar interacções entre moléculas. s=m(1-vp)/f s – coeficiente de sedimentação m – massa da particula v – volume parcial específico p – densidade do meio f – coeficiente de atrito Uma particula com maior massa sedimenta mais rapidamente. Uma particula mais compacta sedimenta mais rapidamente. Uma particula mais densa sedimenta mais rapidamente. A velocidade de sedimentação depende da densidade da solução

10. Análise de proteínas Exemplos de métodos para análise de proteínas: Electroforese em gel; Cromatografia de afinidade; Teste do biureto; Ultra centrifugação; Salting out; Diálise; Anticorpos.

11. Electroforese em gel Em função da carga eléctrica líquida das proteínas, em que a velocidade de migração das proteínas depende da intensidade do campo, da carga da proteína e do quoeficiente de atrito Em função da massa,em que as moléculas de maior peso ficam quase imóveis enquanto que as menores adquirem maior velocidade Em função dos relativos ao ponto isoeléctrico, em que cada proteína mover-se-á até atingir uma posição no gel no qual o pH é igual ao pIda proteína

12. Estudo de Proteínas e Diagnóstico em Medicina • A electroforese desempenha um papel preponderante, por exemplo, na referenciação imediata de algumas anomalias proteicas, como por exemplo: • Mieloma múltiplo; • Macroglobulinémia; • Enteropatiaexudativa; • Sindroma nefrótico; • Cirrose; • Sarcoidose; • Doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas.

13. Diagnóstico de Cirrose Hepática através da Electroforese No diagnóstico da cirrose hepática podemos notar uma diminuição da albumina, por diminuição da catabolização das globulinas no fígado, cuja função está deficiente (insuficiência hepática). Para além disto, denota-se um aumento do nº de proteínas na região β e γ.