Le spore batteriche

1. Le spore batteriche

2. LE SPORE BATTERICHE SONO FORME DI RESISTENZA

3. Descritte da un gruppo di ricercatori in colture di batteri del suolo presi da un recipiente sigillato per 300 anni Nella seconda metà del 1800 Ferdinand Julius Cohn (botanico Polacco) dimostrò come l'acqua bollente uccideva le cellule vegetative del Bacillus subtilis, ma non le endospore mettendo così definitivamente a tacere la vecchia dottrina della "generazione spontanea". • Descritte in mummie egiziane di 4000 anni fa

4. Alcuni bacilli Gram positivi, aerobi ed anaerobi, appartenenti al genere Bacillus e Clostridium, in determinate condizioni ambientali danno luogo alla formazione di particolari cellule strutturalmente e funzionalmente differenziate a cui si da il nome di spore SI ORIGINANO

5. SI ORIGINANO Le spore batteriche sono delle endospore, ossia che originano all’interno della cellula madre, detta anche sporangio La spora, oltre ai componenti strutturali della cellula vegetativa possiede molecole e strutture cellulari specifiche che condizionano caratteristiche biologiche peculiari: è metabolicamente inattiva, altamente resistente agli insulti ambientali e stabile per lunghi periodi di tempo

6. LA CELLULA MADRE SI DISGREGA E LIBERA LA SPORA NELL’AMBIENTE UBIQUITARIE SI ORIGINANO Chi sporula?

7. B. anthracisCARBONCHIO B. cereusTOSSINFEZIONI ALIMENTARI B. subtilisINFEZIONI RESPIRATORIE Bacillus C. botulinumBOTULISMO C. difficileCOLITE PSEUDOMEMBRANOSA C. perfringensGANGRENAGASSOSA C. tetaniTETANO Clostridium ALCUNI BACILLI GRAM POSITIVI COCCHI SporasarcinaPATOGENI OPPORTUNISTI RICKETTSIE Coxiella burnetiFEBBRE Q

8. EPIDEMIOLOGIA ALIMENTAZIONE FARMACEUTICA LE ENDOSPORE SONO RESPONSABILI DI NUMEROSI PROBLEMI

9. SI ELIMINANO STERILIZZAZIONE IN AUTOCLAVE 121°C per 15 minuti alla pressione di 1.05 Kg/cm2 Uccisione di tutte le forme viventi BOLLITURA (100°C) INTERMITTENTE Tre intervalli di 30 minuti seguiti da periodi di raffreddamento Prima del secondo e terzo ciclo di bollitura il materiale viene mantenuto a temperatura ambiente per almeno 8 ore 100°C = uccisione delle forme vegetative Raffreddamento = germinazione delle endospore

10. CARATTERIZZATE DA UNO STATO DI CRIPTOBIOSI IN CUI OGNI SINTESI MACROMOLECOLARE E’ ASSENTE.

11. CARATTERIZZATE DA La criptobiosi è uno stato di vita ametabolico nel quale entrano alcuni organismi semplici in risposta a condizioni ambientali avverse, quali essiccazione, congelamento, e mancanza di ossigeno. Nello stato criptobiotico, tutti i processi metabolici si fermano, impedendo la riproduzione, lo sviluppo e la riparazione. Un organismo in un stato criptobiotico può vivere essenzialmente per un tempo indeterminato fino a quando le condizioni ambientali tornare ad essere ospitali. Quando ciò si verifica, l'organismo tornerà al suo stato di vita metabolico precedente alla criptobiosi.

12. AD ALCUNI BATTERI DI SOPRAVVIVERE IN CONDIZIONI AMBIENTALI SFAVOREVOLI Possono sopravvivere per anni in soluzione di alcool al 70% CONSENTONO CARBONIO AZOTO FOSFORO CARENZA DI

13. ELEVATE TEMPERATURE RADIAZIONIUV CONGELAMENTO AGENTI BATTERICIDI RESISTONO A CONDIZIONI NORMALMENTE LETALI PER LA CELLULA BATTERICA

14. Ogni specie batterica sporigena può essere indotta a formare spore o mantenuta costantemente in fase vegetativa agendo sulla composizione e la disponibilità dei nutrienti La SPOROGENESI è una particolare espressione della capacità di adattamento cellulare alla disponibilità di nutrienti nell’ambiente “Le spore sono prodotte da cellule sane minacciate dalla fame” Knaysi

15. La SPOROGENESI è un processo altamente energetico in quanto richiede una serie di modificazioni morfologiche e la sintesi di nuovi enzimi e metaboliti GLICOLISI

16. Clostridium perfringens Bacillus anthracis Clostridium tetano MORFOLOGIA BATTRIDIO Spora centrale che non deforma la cellula madre CLOSTRIDIO Spora centrale con diametro maggiore che deforma la cellula madre PLETTRIDIO Spora terminale che deforma la cellula madre

17. AL MICROSCOPIO OTTICO IN PREPARATI COLORATI metodo di Gram metodo di Schäffer e Fulton AL MICROSCOPIO ELETTRONICO cellula vegetativa spora SI EVIDENZIANO

18. AL MICROSCOPIO OTTICO IN PREPARATI COLORATI. La spora appare come un corpicciolo rifrangente e incolore all’interno del batterio, essendo la spora difficilmente penetrabile da sostanze quali i coloranti, per la complessità dei suoi involucri SI EVIDENZIANO metodo di Gram

19. ULTRASTRUTTURA Le spore batteriche hanno una struttura molto simile a quella della cellula vegetativa ma si differenziano per il fatto di essere circondate da peculiari involucri responsabili dei peculiari aspetti biologici delle spore

20. ULTRASTRUTTURA La parte centrale, il core, ripete la struttura della cellula vegetativa intorno alla quale si sviluppano una serie di membrane molto peculiari e voluminose

21. Enzimi sporali • Acido dipicolinico CORE PROTOPLASTO IN FORMA QUIESCENTE circondato di una parete sporale • cromosoma addossato alla membrana plasmatica • ribosomi, alcuni tRNA, nessun mRNA • Small acid soluble proteins (SASP). Sono proteine a basso peso • molecolare che consentono alla spora di resistere ai raggi UV. • L’energia è conservata sotto forma di 3-fosfoglicerato, invece che ATP, una • molecola a minore concentrazione energetica ma più stabile • ridotta concentrazione di enzimi della cellula vegetativa • ridotto contenuto di H2O

22. ULTRASTRUTTURA Una sottile membrana di composizione fosfolipoproteica simile alla membrana plasmatica Due rivestimenti formati da proteine molto stabili, lipidi (1-2%) e a volte peptidoglicani, circondano la cortex Formata da peptidoglicani. Circondata da due rivestimenti. Contiene, inoltre, l’acido dipicolinico, un acido che insieme a grandi quantità di calcio stabilizza la struttura

23. CORTEX costituita soprattutto di PEPTIDOGLICANO MODIFICATO • Molti residui di acido N-acetilmuramico sono sostituiti da anelli di acido d lattamico (lattami muramici) siti di attacco degli enzimi della germinazione • Formazione di legami crociati tra il peptidoglicano e il dipicolinato di calcio. Ciò determina contrazione del peptidoglicano ed eliminazione di acqua per “strizzamento” • E’ una struttura flessibile poiché il peptidoglicano sporale contiene un basso numero di legami trasversi, rispetto a quello della cellula vegetativa. Ciò è fondamentale per mantenere la disidratazione sporale

24. coat interno (elettronlucido) TUNICASPORALE coat esterno (elettrondenso) ESOSPORIO Contiene diverse proteine cheratino-simili, molto stabili, ricche di ponti disolfuro. L’impermeabilità di questo strato rende le spore resistenti alle sostanze antibatteriche ed ai coloranti E’ una struttura accessoria, di natura fosfolipidica, simile alla membrana plasmatica. Contiene basse concentrazioni di acidi teicoici, acido diaminopimelico e glucosammina. Quando presente determina massima rifrangenza e completa impermeabilità ai coloranti

25. CORTEX COATS ESOSPORIO • TERMORESISTENZA • intrinseca composizione molecolare • disidratazione • mineralizzazione Il ridotto contenuto di acqua delle spore rende le proteine sporali meno attive e più resistenti alla denaturazione termica. Contribuisce a tale peculiare aspetto biologico delle spore la presenza di acido dipicolinico complessato con ioni calcio, sotto forma di dipicolinato di calcio. La comparsa della termoresistenza si osserva solo dopo che la cellula acquisisce rifrangenza per riduzione del contenuto di acqua e dopo che l’accumulo di acido dipicolinico ha raggiunto un limite soglia

26. CORTEX COATS ESOSPORIO • TERMORESISTENZA • disidratazione • intrinseca composizione molecolare • mineralizzazione RESISTENZA Al LISOZIMA RESISTENZA AI SOLVENTI ORGANICI

27. SPORULAZIONE Processo di differenziamento cellulare • DIVISIONE ASIMMETRICA • DA UNA CELLULA BATTERICA SI GENERA UNA SOLA SPORA • DIFFERENZIAMENTO CELLULARE • ATTIVAZIONE DI NUOVI PROCESSI BIOSINTETICI

28. Addensamento del materiale nucleare • Divisione del cromosoma e separazione verso il polo opposto • La membrana citoplasmatica si introflette con divisione asimmetrica della cellula in due compartimenti di diversa grandezza • Si forma la prespora • Si completa il setto di divisione e si formano le diverse membrane che caratterizzano la spora L’INTERO PROCESSO DURA CIRCA 8 ORE E PUÒ ESSERE SUDDIVISO IN 6-7 STADI OGNUNO DEI QUALI E’ CARATTERIZZATO DA EVENTI BIOCHIMICI E MORFOLOGICI IN PARTE SPECIFICI

29. Il processo di sporulazione nelle prime fasi è reversibile. L’evento più importante della sporulazione è la sintesi di acido dipicolinico e delle SAPS, che legandosi al DNA lo proteggono dalle radiazioni UV

30. Nelle prime fasi del processo di sporulazione è frequente la produzione da parte dello sporangio di piccoli peptidi ad attività antibatterica

31. La sporulazione inizia quando si verificano due condizioni • carenza di nutrienti • alta densità cellulare ATTIVAZIONE Il monitoraggio della densità cellulare si realizza con un MECCANISMO “QUORUM SENSING” È un meccanismo di comunicazione tra cellule batteriche che ha come finalità il controllo dell’espressione genica in funzione della densità di popolazione La comunicazione tra cellule avviene per mezzo di molecole segnale

32. MECCANISMO “QUORUM SENSING” • secrezione e riconoscimento di • EDF-1 (fattore di differenziamento extracellulare). Si lega al batterio e segnala ad esso di iniziare il processo di sporulazione. La sporulazione parte quindi all’inizio della fase stazionaria di crescita • < [GTP] (fattore di differenziamento intracellulare). La ridotta concentrazione di GTP rappresenta il segnale biochimico intracellulare che dà l’avvio alla sporulazione ATTIVAZIONE

33. ATTIVAZIONE La formazione di spore implica la produzione di numerose nuove strutture, enzimi e metaboliti, assieme alla scomparsa di numerosi componenti della cellula vegetativa. Affinchè ciò si attui deve essere attivata una serie di geni, i cui prodotti determinano la formazione e la composizione finale della spora mentre un’altra serie di geni, quelli necessari alle funzioni della cellula vegetativa, deve essere inattivata. La compartimentalizzazione dell’espressione genica riguarda modificazioni della specificità trascrizionale della RNA polimerasi

34. RNA-polimerasi batterica CELLULA VEGETATIVA I geni della cellula vegetativa sono letti da molecole di RNA polimerasi che contengono fattori sA di riconoscimento. La subunità s riconosce il promotore e legge il DNA in punti specifici sA sH sE SPORULAZIONE La RNA polimerasi viene clivata diventando incapace di riconoscere i fattori sigma della cellula vegetativa. Vengono sintetizzati nuovi fattori sigma, ciascuno specifico per il gruppo di geni della sporulazione sF sG sK

35. RNA-polimerasi batterica SPORULAZIONE Tale processo porta quindi ad una modificazione della RNA polimerasi che rende capace l’enzima di riconoscere solo i promotori dei geni sporali

36. Divisione del DNA • Attivazione di SpoOA “regolatore della risposta” • Sintesi del fattore sH (specifico per il primo gruppo di geni della sporulazione) • Formazione del setto di divisione asimmetrico, primo • evento irreversibile ATTIVAZIONE < [GTP] è il segnale biochimico intracellulare che da l’avvio alla sporificazione; inoltre, porta alla sintesi del fattore sH e alla fosforilazione della proteina SpoOA, che dereprime i geni d’inizio della sporulazione

37. EsH e SpoOA attivano la trascrizione de fattori sF e sE • Formazione della PRESPORE e della CELLULA MADRE • Sintesi di SpoIIID (proteina binding del DNA) • Localizzazione di sE nella cellula madre • Localizzazione di sF nella prespora

38. La sporulazione determina l’attivazione di circa 200 geni che codificano sia per proteine strutturali che regolatrici e che controllano una cascata di geni molto complessa

39. sF nella prespora attiva la trascrizione di sG e dei fattori di attivazione di sE nella cellula madre • La prespora è inglobata da una doppia membrana citoplasmatica • Sintesi delle SAPS nella prespora • La prespora sintetizza i componenti della PARETE SPORALE • La cellula madre sintetizza i componenti della CORTEX (peptidoglicano modificato e acido dipicolinico)

40. Il fattore sE nellacellula madreattiva la trascrizione di sK e dei fattori di attivazione di sG nella prespora Lo scambio di segnali bidirezionali (criss-cross) cellula madre -prespora e viceversa assicura che la sequenza degli eventi venga rispettata • Sintesi di GerE (proteina bindig del DNA) • La cellula madre completa la sintesi dei componenti della cortex e sintetizza i componenti dei COATS

41. Lo scambio di segnali bidirezionali (criss-cross) cellula madre -prespora e viceversa assicura che la sequenza degli eventi venga rispettata

42. LA SPORA MATURA SI LIBERA NELL’AMBIENTE La cellula madre si lisa e la spora matura è liberata nell’ambiente

43. GERMINAZIONE In condizione ambientali favorevoli una spora ritorna alla condizione di cellula vegetativa in 90’ e si suddivide in 3 fasi: • ATTIVAZIONE • GERMINAZIONE VERA E PROPRIA • ESOCRESCITA

44. GERMINAZIONE IN VITRO Si può realizzare esponendo le spore per 1 h alla temperatura di 60°C in presenza di indutturi del processo di germinazione quali zuccheri, amminoacidi o lisozima

45. ATTIVAZIONE Perdita delle attività biologiche della spora senza che siano evidenti modificazioni morfologiche Stimolo traumatico (shock termico) INDUTTORE: FATTORI DI GERMINAZIONE: L-alanina, Asparagina, inosina, glucosio, fruttosio, Ca++ Mn++

46. Attivazione Una delle ipotesi più accettabile per spiegare il fenomeno dell’attivazione si riferisce alla rottura dei ponti S-S delle proteine dei coats, responsabili della maggiore permeabilità della spora attivata. Se non si aggiungono gli induttori del processo di germinazione, la spora non entra nella seconda fase.

47. GERMINAZIONE Perdita di frammenti degradati di peptidoglicano e dipicolinato di Ca++. Assunzione di H2O e aumento di volume.Perdita della termoresistenza e della resistenzaall’essiccamento, al lisozima e agli agenti chimici ESOCRESCITA La cellula vegetativa fuoriesce completamente dagli involucri sporali e riprende la sua normale attività metabolica. Ripresa della sintesi proteica e degli acidi nucleici