Infecção por micoplasmas do trato urogenital e micoplasmas emergentes em indivíduos com HIV/AIDS

1. Infecção por micoplasmas do trato urogenital e micoplasmas emergentes em indivíduos com HIV/AIDS Caio M. M. de Cordova Universidade Regional de Blumenau - FURB

2. Histórico • 1967: • Classe Mollicutes • Ordem Mycoplasmatales • Denominação genérica • Molicutes • Hoje • 4 ordens, 5 famílias • 8 gêneros • > 200 espécies conhecidas • Mais recente: M. amorphiforme (2003)

3. Características • Os microrganismos auto-replicativos com o menor genoma • Habilidades biosintéticas limitadas • Ausência de parede celular • Pleomorfismo celular • Requerem esteróides nos meios de cultura

4. Possíveis co-fatores do HIV • Micoplasmas • Micobactérias • Salmonela • Leishmania • Toxoplasma • Citomegalovírus • Herpesvírus • Epstein-Barr vírus • HTLV-12 • outros retrovírus Montagnier e Blanchard. Clin Infect Dis 17:S309-15, 1993.

5. Objetivos Objetivo Geral Investigar a infecção por espécies de micoplasmas do trato urogenital e espécies emergentes de micoplasmas em indivíduos com HIV/AIDS, assim como a incidência da resistência aos antibióticos comumente utilizados no tratamento, e implantar estes testes no Laboratório de Análises Clínicas de nossa universidade, para o atendimento a população no âmbito do SUS.

6. Objetivos • Objetivos Específicos • Investigar a incidência de infecção por Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e U. parvum no trato urogenital de indivíduos com HIV/AIDS; • Investigar a incidência de infecção por Mycoplasma genitalium, M. fermentans e M. penetrans no trato urogenital de indivíduos com HIV/AIDS; • Avaliar a eficiência da detecção da infecção por micoplasmas por métodos moleculares (PCR) em relação a cultura; • Avaliar a resistência dos micoplasmas aos principais antibióticos utilizados no tratamento; • Investigar uma eventual correlação entre infecção por micoplasmas e o desenvolvimento da imunossupressão durante a infecção pelo HIV; • Implantar o teste para a determinação da resistência dos micoplasmas aos antibióticos no Laboratório de Análises Clínicas de nossa instituição, no âmbito do SUS; • Implantar os testes de PCR para a detecção de espécies emergentes de micoplasmas no Laboratório de Análises Clínicas de nossa instituição, no âmbito do SUS.

7. Metodologia Aplicada Pacientes e Amostras: amostras de primeiro jato de urina (cerca de 20 mL) de homens infectados pelo HIV, após consentimento livre e esclarecido. Serão coletadas amostras de cerca de 100 indivíduos, nos diferentes estágios da infecção pelo HIV. Serão avaliados também os dados sobre os níveis de imunodepressão (linfócitos CD4 e CD8), carga viral do HIV, e cinética de progressão da doença.

8. Metodologia Aplicada Cultura de micoplasmas:As amostras obtidas são cultivadas em meio sólido A7, meio líquido de uréia (U10), meio SP4 liquido e sólido e o meio líquido de Arginina (MLA), com incubação em condições de 2-3% de CO2 por no mínimo 48 horas a 37 ºC. As amostras são quantificadas pelo método de microtitulação, em seus respectivos meios líquidos. As culturas que não apresentarem crescimento em após 7 dias de cultivo são consideradas negativas

9. Meio sólido (A7) Meio de Arginina M. hominis Meio uréia (U10) U. urealyticum / U. parvum • Cultura para M. hominis e U. urealyticum / U. parvum Meio de transporte (A3Xb) titulação

10. Cultura para M. penetrans,M. genitalium e M. fermentas Meio sólido (SP4) Meio de glicose (SP4) ? Meio de transporte (A3Xb)

11. Metodologia Aplicada Resistência dos micoplasmas aos antimicrobianos: as cepas isoladas das amostras clínicas serão testadas pelo método de Concentração Inibitória Mínima (MIC) por microdiluição em caldo, para os antibióticos mais utilizados no tratamento: azitromicina, claritromicina, doxiciclina, eritromicina, levofloxacin e ofloxacin

12. diluição

13. Metodologia Aplicada Detecção de micoplasmas por PCR: alíquotas de 10 mL das amostras de urina serão centrifugadas, e o DNA do sedimento será extraído com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, após lise com proteinase K em tampão contendo Triton X-100. O DNA das amostras será amplificado com oligonucleotídeos específicos para M. hominis, U. urealyticum e U. parvum, e também com oligonucleotídeos específicos para M. genitalium, M. fermentans e M. penetrans. Os produtos de PCR serão analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%.

14. PCR para M. genitalium • PCR para M. penetrans • PCR para M. fermentans 100 bp 1 2 3 4 5 6 410 bp Detecção dos produtos da PCR para Mycoplasma penetrans nas amostras clínicas em gel de agarose a 0,8%, corado com brometo de etídio, sob luz U.V. Marcador de peso molecular: 100 bp DNA Ladder, Linhas 1: controle positivo; 2: controle de reação; 3 e 4: amostras positivas; 5 e 6: amostras negativas.

15. Resultados e Comentários Pacientes e Amostras: em andamento, cerca de 25 amostras coletadas com consentimento. Cultura de micoplasmas:

16. Resultados e Comentários Instalação do laboratório:

17. Impactos do Projeto • Esperamos poder determinar a incidência da resistência dos micoplasmas aos antibióticos utilizados no tratamento em nossa população. • Esperamos também determinar qual o melhor método para a pesquisa das diferentes espécies de micoplasmas na população de indivíduos infectados pelo HIV, alem de determinar uma eventual relação entre a infecção por espécies emergentes de micoplasmas e a progressão da AIDS.

18. Aplicabilidade para o SUS Comprovada a utilidade da implantação dos testes de resistência dos micoplasmas aos antibióticos, no âmbito do SUS, possibilita-se promover o uso racional destes medicamentos. A implantação das metodologias de pesquisa de micoplasmas, no âmbito do SUS, através de nosso laboratório universitário, pode de grande contribuição na compreensão da infecção pelo HIV e suas infecções relacionadas, reduzindo a morbidade, e promovendo uma melhora na qualidade de vida destes indivíduos

19. Equipe: Prof. Dr. Caio M. M. de Cordova – cmcordova@furb.br Prof. MSc. Eduardo M. Dalmarco Prof. Alessandro Conrado Silveira Nayara Kelly Benenuti Camila Simões Benfatti Samuel M. de Cordova Laynara K. Grutzmacher Gabriele Zateli