TRANSGĒNU DZĪVNIEKU IEGŪŠANA UN IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ

1. TRANSGĒNU DZĪVNIEKU IEGŪŠANA UN IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ Transgēni, cilmes šūnas, nokauti un kloni

2. JAUTĀJUMI • Agrīnā embrioģenēze un cilmes šūnas • Vienkāršie transgēni • Gēnu nokauti • Dzīvnieku kloni • Pieaugušās cilmes šūnas un audu inženierija

3. Transgēnu dzīvnieku iegūšana • Transgēnie dzīvnieki tiek iegūti, izmantojot trīs metodes: • Gēnu mikroinjekcija apaugļotas olšūnas pronukleusā, • embrionālo cilmes šūnu injekcija blastocistā, • apstrāde ar retrovīrusiem. http://www.ag.uiuc.edu/~vista/html_pubs/irspsm91/transfor.html

4. Transgēnu dzīvnieku iegūšana

5. Transgēnu dzīvnieku iegūšana Pirmo metodi plaši izmanto transgēnu peļu iegūšanai. Pēc mikroinjekcijas no peles izņem nesen apaugļotus vienšūnas embrijus. šim nolūkam izmanto mikromanipulatorus un īpaši aprīkotu mikroskopu. Ar speciālu pipeti un vakuma palīdzību embriju fiksē, un tās pronukleusā ar kapilāru adatu ievada klonējamo DNS. Pēc tam embrijus pārnes aizvietotājmātēs, kuras tos iznēsā. 1 – 4 % no injicētajiem embrijiem dod transgēnus pēcnācējus.

6. Zigotas veidošanās Olšūnas ietver apvalki: vitelīna membrāna (zona pellucida zīdītājdzīvnie-kiem) un folikulāro šūnu slānis (corona radiata zīdītājdzīvnie-kiem). bartleby.com/ 107/5.html

7. Agrīnā embrioģenēze

8. Agrīnā embrioģenēze Oocīts > Zigota > Blastomers/Pāršūnu stadijas > Morula > Blastocists > Gastrula > Embrijs

9. Transgēnu dzīvnieku iegūšana

10. Transgēnu dzīvnieku iegūšana Otrā metode. No blastocista (dažas dienas pēc apaugļošanas) iegūst embrionālās cilmes (EC) šūnas. Tās var audzēt neierobežoti ilgi laboratorijā un tās nezaudē spēju augt un diferencēties par jebkuru dzīvnieka audu tipu, veidot veselu jaunu dzīvnieku. EC šūnas in vitro transformē ar svešajiem gēniem un ar mikroinjekciju ievada citā blastocistā. Aizstājējmātes iznēsā dzīvniekus, kurus veido divu dažādu tpu šūnas, transgēnās un parastās. Ja transgēnās EC šūnas ir veidojušas dzīvnieku spermatozoīdu vai olšūnu priekštečus – šadu dzīvnieku pēcteči visi būs transgēni.

11. Cilmes šūnas Cilmes šūnas ir relatīvi vienkāršas šūnas, kuras spēj ātri augt, neierobežoti ilgi dalīties šūnu kultūrā un diferencēties par specializētām šūnām. Izšķir: embrionālās cilmes šūnas pieaugušās (somātiskās) cilmes šūnas

12. Cilmes šūnu diferencēšanās potenciāls: totipotentas (zigota); pluripotentas; (embrionālās); multipotentas (pieaugušās).

13. Embrionālās cilmes šūnas Priekšrocības: vieglāk izmantot; neierobežoti ilgi aug kultūrā; nerada imūno atbildi. Trūkumi: teratomas (?);ētiskas problēmas.

14. EC ŠŪNAS

15. EC ŠŪNAS

16. Transgēnu dzīvnieku iegūšana

17. ES ŠŪNAS

18. Trešā metode – ar retrovīrusu palīdzību

19. Vienkāršie transgēni Nejauša integrācija Tandemu un polimeru veidošanās Regulēšanas problēmas Apklusināšana / delēcijas / metilēšana

20. Vienkāršie transgēni Transgēnu identificēšana un integrācijas vietas lokalizēšana: fenotips Southern analīze PCR FISH

21. Vienkāršie transgēni Pārnesto gēnu regulēšanas problēmas: inducējami promoteri enhanseru lokalizācija izolatoru -MAR domēnu loma lokusa (pozīcijas) efekts lokalizācijas sekvences

22. Transgēna ekspresiju kavē: • cDNS, nevis hromosomālās DNS klonēšana; • integrācija lielā kopiju skaitā; • bagātas sekvences (dzīvniekiem neraksturīgas); • (4) integrācija vāji ekspresējamā rajonā- “pozīcijas efekts”.

23. Vienkāršie transgēni Pārnesto gēnu apklusināšana: delēcijas (Southern analīze) metilēšana 5-meC atlikums 5’-CCGG-3’ secībās, pierādīšana ar genoma un ķīmisko sekvenēšanu (DMS un tiosulfāta apstrādes jūtība)

24. Izolatori = LCR secības (locus control regions) Gēnu grupas tiek nodalītas no pārējās hromosomas ar specifiskām izolatoru DNS secībām. Izolatorus veido vairāki elementi: a) sailenseri, kas bloķē integrētā transgēna tuvumā esošo enhanseru darbību; b) hromatīna atšķetinātāji, kas inducē histonu deacetilēšanu, ko pavada lokāla histonu un DNS demitelēšana; c) AT- bagāti matriksa saistības rajoni (MAR, matrix-attached regions).

25. Pārnesto gēnu regulēšanas problēmas:

26. TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI Nozīmīgākie procesi: attīstības bioloģija; no farming uz pharming ; klonēšana;akvakultūra; Izmantojamie organismi un produkti: visbiežāk zivis; govis un jaunus proteīna veidus saturošs piens; perspektīvā: dzīvnieki ar iznīcinātu prionu proteīnu gēnu. Mērķi: ražošanas efektivitāte; funkcionāla (terapeitiska) pārtika, pārtikas drošība.

27. “FARMING” VIETĀ “PHARMING” http://www.nal.usda.gov/bic/Education_res/iastate.info/bio10.html

28. “FARMING” VIETĀ “PHARMING”

29. GM DZĪVNIEKU PIENĀ SINTEZĒTIE PROTEĪNI

30. PEĻU SLAUKŠANA Pelēm intraperitoneāli injicē oksitocīnu (līdz 5 IU). Pēc tam, ar precīzi regulējama vakuma pievadīšanu piena dziedzeriem, iespējams iegūt līdz 1 ml piena. Izmantojot līdzīgu metodi, no trušu mātēm laktācijas periodā iespējams iegūt līdz 100 ml piena dienā. Līdzīgus daudzumus piena iespējams iegūt arī no izolētiem piena dziedzeriem.

31. PIRMAIS TRANSGĒNAIS DZĪVNIEKS

32. Cūkas, kas siekalās ekspresē baktēriju enzīmu fitāzi izdala vidē ap 75% mazāk fosfātu nekā parastās cūku šķirnes, tādejādi ievērojami samazinot lopkopības radīto piesārņojumu. Golovan SP, Meidinger RG, Ajakaiye A, Cottrill M, Wiederkehr MZ, Barney DJ, Plante C, Pollard JW, Fan MZ, Hayes MA, Laursen J, Hjorth JP, Hacker RR, Phillips JP, Forsberg CW. Pigs expressing salivary phytase produce low phosphorus manure. Nat Biotechnol 2001, 19: 741–745.

33. Fitāts – inozitolheksafosfāts; Viena no galvenajām fosfora uzkrāšanas formām augos, īpaši kviešos. Stiprs helatējošs savienojums, saista divalentos katjonus, piem., Ca2+. Tiek noārdīts atgremotāj dzīvnieku kuņģī, citu dzīvnieku gremošanas traktā – nē. Baktērijas, noārdot fitātu fermu atkritumos, piesārņo notekūdeņus ar fosforu.

34. Cūkas, kas ekspresē spinātu enzīmu desaturāzi uzkrāj vairāk nepiesātinātu taukskābju, tādejādi paaugstinot gaļas kvalitāti. Saeki K, Matsumoto K, Kinoshita M, Suzuki I, Tasaka Y, Kano K, Taguchi Y, Mikami K, Hirabayashi M, Kashiwazaki N, Hosoi Y, Murata N, Iritani A. Functional expression of a Delta12 fatty acid desaturase gene from spinach in transgenic pigs. Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101: 6361–6366.

35. Paredzams, ka kazas un govis, kas pienā ekspresēs tādus baktērijas nonāvējošus proteīnus kā cilvēka lizocīmu, laktoferīnu un lizostafīnu būs mazāk jūtīgas pret mastītu. To piens būs izturīgāks pret bojāšanos baktēriju iedarbībā un to varēs lietot cilvēki, kas slimo ar bakteriālām infekcijām. Kerr DE, Plaut K, Bramley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, Wells KD, Wall RJ. Lysostaphin expression in mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat Biotechnol 2001, 19: 66–70. Murray J, Reh W, Anderson G, Maga E. Changing the composition of milk to improve human health. In: Transgenic Animal Research, Conference IV, Tahoe City California, 2003, p 32.

36. Transgēnas vistas Vistas aug ātrāk nekā aitas un tās var turēt lielā skaitā salīdzinoši mazās platībās. Vistas olas baltums satur vairākus gramus proteīna. Līdz šim izmantotas divas metodes, lai iegūtu vistas, kas nes un ekspresē svešus gēnus. 1 ) Embrijus inficē ar vīrusa nesēju, kas satur terapijā izmantojama cilvēka proteīna gēnu un vistas gēna (piem., lizocīma) promotera secības, kas nodrošina proteīna uzkrāšanu olas baltumā. 2) Ar cilvēka gēnu un atbilstošiem promoteriem transformē gaiļu spermatozoīdus. Orientējoši dati rāda, ka vistas var producēt līdz 0,1 gramam cilvēka proteīna katrā izdētajā olā

37. TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM Ātri augošs, lēts, “barojošs un videi draudzīgs” "AquAdvantage" lasis Aqua Bounty Technologies, Bostonas priekšpilsēta, 2003. g. oktobrī pieprasījums FDA; In September 2010, an FDA advisory panel indicated that the fish is "highly unlikely to cause any significant effects on the environment" and that it is"as safe as food from conventional Atlantic salmon"

38. TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM Sārti fluorescējošas zebru zivtiņas: ir vai nav pārtika ?

39. TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM

40. GĒNU NOKAUTI Gēnu nokauts – organisma modifikācija, kas ar mērķētu delēciju vai inserciju palīdzību inaktivē specifisku gēnu. Gēnu nok-ins – organisma modifikācija, kas ar mērķētu inserciju novieto funkcionējošu gēnu lokusā, kur atrodas tā paša gēna nefunkcionējoša kopija.

41. NOKAUTI

42. NOKAUTI

43. NOKAUTI

44. CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS

45. CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS

46. CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS

47. ESTROGĒNU-INDUCĒJAMI NOKAUTI

48. TET-INDUCĒJAMI NOKAUTI

49. ĢENĒTISKAIS FONS UN NOKAUTU FENOTIPS

50. KLONĒŠANA Organismu vai šūnu kopiju savairošana veģetatīvā (bezdzimuma) ceļā Reproduktīvā klonēšana Reproduktīvās klonēšanas mērķis ir radīt dzīvnieku, kuram ir tāda pati DNS kā kādam citam dzīvniekam. To panāk pārnesot somātiskās šūnas kodolu uz olšūnu, kuras pašas kodols ir iznīcināts. Terapeitiskā klonēšana Terapeitiskās klonēšanas mērķis ir radīt slimas personas audu vai orgānu veselu kopiju transplantācijas nolūkam.