Ćwiczenie 3 Hydroliza DNA enzymami restrykcyjnymi. Oczyszczanie DNA po trawieniu.

1. Ćwiczenie 3 Hydroliza DNA enzymami restrykcyjnymi. Oczyszczanie DNA po trawieniu. • Protokół 3 • Przygotowanie insertu do klonowania - trawienie fragmentu DNA oczyszczonego z żelu endonukleazami restrykcyjnymi HindIII i EcoRI. • Mieszanina reakcyjna • DNA 34 µl • bufor R+ 4μl • EcoRI0,5μl (10 jednostek) • HindIII1 µl (10 jednostek) • Woda dejonizowana 0,5 µl • Razem: 40 µl • Mieszaninę zwirować (3000obr/min) i inkubować 1h w temp. 37˚C

2. Protokół 3a • Oczyszczanie DNA po trawieniu – DNA Clean-Up • Do probówki zawierającej DNA dodać 400 µl roztworu G i wymieszać przez odwracanie probówki lub worteksowanie. • Całość nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA i wirować przy 6000 RPM przez 30s • Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki; dodać do kolumny 600 µl roztworu płuczącego A1 i wirować j.w. • Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki; dodać do kolumny 300 µl roztworu A1 i wirować przy 12000 RPM przez 30s. • Osuszoną kolumnę umieścić w nowej probówce i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 40 µl buforu TE (lub jałowej wody destylowanej ); • Inkubować próbkę 3-5 min. w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 12000 RPM przez 30s.

3. Elektroforeza kwasów nukleinowych • Elektroforeza stwarza możliwości fizycznego rozdziału biomolekuł, takich jak białka czy kwasy nukleinowe. • Szybkość migracji rozdzielanych w polu elektrycznym cząsteczek białek czy kwasów nukleinowych jest funkcją ich rozmiaru, ładunku i konformacji przestrzennej.

4. Elektroforeza agarozowa DNA • Powszechnym sposobem rozdziału fragmentów kwasów nukleinowych jest zastosowanie agarozy jako matrix. • Wielocukier agaroza jest wysoko oczyszczoną formą agaru. • W celu przygotowania żelu, pył agarozowy jest zagotowywany w buforze wykorzystywanym do elektroforezy (aż do całkowitego rozpuszczenia) i wylewany do specjalnego „naczynka” (ang. tray), gdzie zestala się w żel. • Przed wylaniem żelu do naczynka, na jego końcu mocowany jest specjalny grzebień, który po stężeniu żelu powoduje powstawanie studzienek do nakładania próbek. • Pojemność studzienek uzależniona jest od szerokości i grubości „zębów” grzebienia, który został w tym celu użyty. • W pełni stężały żel umieszczany jest w naczyniu do elektroforezy, gdzie zalewany jest buforem elektroforetycznym. • Po nałożeniu próbek do studzienek żelu przykładamy odpowiednie napięcie (lub natężenie) i rozdzielamy przez określony w metodyce czas. • Agaroza działa jak „sito molekularne” (ang. molecular sieve); małe i zwarte struktury przemieszczają się szybciej niż większe, bardziej rozgałęzione. • Dla przykładu, plazmidy, które mogą występować w trzech podstawowych formach (liniowej, otwartej kolistej i superzwiniętej) w tych samych warunkach elektroforetycznych migrują w różny sposób (najszybciej forma superzwinięta, następnie liniowa, na końcu otwarta kolista).

5. Elektroforeza agarozowa DNA • Należy mieć na uwadze fakt, iż na tempo migracji różnych form DNA mogą wpływać inne czynniki i ich wzajemne oddziaływania (np. stężenie bromku etydyny w żelu, typ buforu itp.) • Wyższe stężenia agarozy w żelu powodują większe jego usieciowienie; powoduje to spowolnienie migracji wszystkich rozdzielanych cząsteczek, jednak w przypadku cząsteczek dłuższych jest ono większe niż w przypadku cząsteczek krótszych. • Bufor, który jest wykorzystywany w elektroforezie musi być odpowiednim przewodnikiem prądu elektrycznego. • Dodatkowo, nie może on niekorzystnie wpływać na kwasy nukleinowe; zwykle zawiera EDTA, związek zapobiegający uaktywnieniu się nukleaz (jako czynnik chelatujący), których to kofaktorami są m.in. dwuwartościowe jony Mg++ • Stężenie agarozy dobierane jest do długości rozdzielanych cząsteczek DNA, i kształtuje się następująco: • 0.3 % 5-60 kpz • 0.6 % 1-20 kpz • 0.9 % 0.8-10 kpz • 1.2 % 0.5-7 kpz • 1.5 % 0.2-3 kpz • 2.0 % 0.1-2 kpz

6. Rycina 1: Rozdział fragmentów DNA w żelach agarozowych o różnym stężeniu; dłuższe fragmenty są lepiej uwidocznione w żelu 0.7%, krótsze w 1,5%. Wskazany fragment DNA ma długość 1000 pz. Rycina 2: Migracja różnych form DNA w identycznych warunkach elektroforetycznych

7. Żele obojętne • Żele agarozowe są najczęściej poddawane napięciu od 20 do 150 volt. Wyższe napięcie jest ograniczone ze względu na zwiększone wydzielanie ciepła, co niekorzystnie wpływa na jakość rozdziału DNA. • Przy niskich napięciach migracja jest liniowo proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Migracja jest odwrotnie proporcjonalna do log długości rozdzielanego fragmentu. • Ponadto, „superzwinięte” (ang. supercoiled) i koliste cząsteczki DNA migrują w różnym tempie niż formy liniowe DNA; jednoniciowe DNA i RNA migrują w podobnym tempie, aczkolwiek najczęściej szybciej niż dwuniciowe DNA o tej samej długości. • Bromek etydyny jest często dodawany do żelu agarozowego przed elektroforezą, co jest niewątpliwie wygodne, aczkolwiek postępowanie takie powoduje przechodzenie i gromadzenie się tej toksycznej substancji w buforze obecnym w naczyniu elektroforetycznym; • takie postępowanie jest bardzo dyskusyjne. Lepiej jest wybarwiać żel w roztworze 1xTBE z bromkiem etydyny (EtBr) o stężeniu 0.5µg/ml po zakończeniu elektroforezy. • Żele są „kalibrowane” poprzez nałożenie markera masowego DNA (fragmenty o znanej długości) obok próbek eksperymentalnych. • Mając na uwadze fakt, iż koncentracja soli wpływa na tempo migracji, próbki eksperymentalne i marker masowy powinny być zawieszone w tym samym buforze. • Wszystkie próbki powinny być wymieszane w stosunku 9:1 w barwniku obciążającym (10 x). Ważne jest, aby podgrzać próbki przez 1 minutę w 65°C w celu rozerwania lepkich końców przed nałożeniem na żel.

8. Elektroforeza agarozowa DNA • Żele obojętne • Lepkie końce bardzo wolno denaturują w temperaturze 0 °C, dlatego też przed elektroforezą należy umieścić próbki na lodzie (nie dłużej niż 5 minut). • Próbki do studzienek nakładamy powoli i spokojnie. • Studzienki mają różną pojemność, ale należy pamiętać, aby nie przepełniać ich. • DNA migruje w kierunku elektrody + (czerwonej). • Żele zasadowe • W niektórych sytuacjach, kwasy nukleinowe muszą być rozdzielane jak cząsteczki jednoniciowe (np. jedna nić jest dużo dłuższa niż druga); • dokonujemy tego przez zastosowanie żeli zasadowych (zamiast neutralnego TBE opisanego powyżej) • Żele przygotowujemy na wodzie, a następnie moczymy przez 30 minut w zasadowym roztworze do elektroforezy (zasady szybko hydrolizują agarozę powyżej 50°C, dlatego żel przygotowujemy na wodzie i następnie zanurzamy w buforze alkalicznym). • Bromek etydyny nie wiąże się z DNA w środowisku alkalicznym, a np. RNA hydrolizuje przy pH 9.5 i nie może być analizowany w takich żelach

9. Elektroforeza agarozowa DNA • Żele LMP (ang. low melting-point) • Żele o niskiej temperaturze topnienia mogą być używane do przygotowywania fragmentów DNA do wielu reakcji (np. ligacji) • Żele LMP są znacznie droższe od zwykłej agarozy, topnieją w temperaturze około 50°C, zestalają się natomiast w temperaturze poniżej 37°C. • Przed rozdziałem żele LMP powinny być schłodzone do 4ºC, rozdzielane przy niskich natężeniach; należy obchodzić się z nimi bardzo ostrożnie! • Fragmenty DNA można wyciąć z żelu po barwieniu, przemyć w dużej ilości wody, a następnie rozpuścić w 50ºC. • Alternatywną metodą usunięcia agarozy jest ekstrakcja fenolem.

10. Elektroforeza agarozowa DNA • Skład buforów wykorzystywanych w elektroforezie DNA • 5 x TBE (ilość na 1 litr): Tris-base 54 g, Kwas borowy 27.5 g, EDTA 0.5M 20 ml • 50 x TAE (ilość na 1 litr): Tris-base 242 g, lodowaty kwas octowy 57.1 ml, EDTA 0.5M 100 ml • (10 x) barwnik obciążający (ilość na 1 ml): Glicerol (80%) 600 µl, Xylene cyanol 2.5 µg, Bromophenol blue 2.5 µg, H2O 400 µl • Bufor alkaliczny (ilość na 1 litr): NaOH 10M 5 ml, EDTA 0.5M 2 ml • 1xTE: Tris 10 mM, EDTA 1mM, pH 8.0 with HCl

11. Elektroforeza agarozowa DNA • żel może być przygotowywany z dodatkiem roztworu bromku etydyny (pozwala to na oszczędność czasu) związanego z barwieniem • rozdział DNA w takim żelu może być nieznacznie spowolniony, poza tym jest to silny czynnik mutagenny, więc powinien być stosowany ostrożnie • zasadniczo plazmid kolisty przemieszcza się szybciej niż plazmid pocięty (forma liniowa) • można zobaczyć wiele prążków tego samego DNA w zależności od formy: superzwinięty, zrelaksowany, denaturowany, liniowy) • większość izolacji całych plazmidów zawiera co najmniej dwie różne formy DNA, które odpowiadają formie superzwiniętej i naciętej (ang. nicked circles) • wyższa koncentracja DNA może opóźniać przemieszczanie prążka DNA. Podobny efekt może wywierać wyższa koncentracja soli w buforze • smuga może wskazywać na degradację DNA przez nukleazy

12. Elektroforeza agarozowa DNA • jeśli nakładamy próbkę DNA do studzienki i DNA jest zanieczyszczone etanolem lub olejem mineralnym, albo jeśli żel nie jest kompletnie zatopiony w buforze, nanoszony roztwór DNA może wyciekać ze studzienki • jeśli istnieje taki problem można użyć więcej barwnika obciążającego, albo przygotować barwnik obciążający z TAE zamiast wody, lub zastosować glicerol i dobrze wymieszać • Uważać, żeby światło UV nie zniszczyło DNA. Chociaż światło UV transiluminatora powinno być bezpieczne dla DNA badającego, generalnie należy nie wystawiać DNA na działanie UV zbyt długo, ponieważ może to wpłynąć na niepowodzenie ligacji • Dodatek 1-10mM guanoyzny do żelu może chronić przed uszkodzeniami DNA. • Elektroforeza może być wykonana przy stałym napięciu lub natężeniu, jednakże bezpieczniej użyć stałego napięcia • Przy wyższym napięciu, fragmenty dłuższe zaczną migrować proporcjonalnie szybciej niż krótsze • najlepszy rozkład fragmentów dłuższych niż 2000 pz osiągamy przez zastosowanie nie więcej niż 5V na cm żelu (wartość cm jest odległością pomiędzy dwoma elektrodami, a nie długością żelu!).

13. Diagnozowanie błędów elektroforezy agarozowej DNA • Widoczne bardzo słabe lub niewidoczne prążki DNA w żelu • Niewystarczająca ilość albo stężenie DNA nałożonego na żel. Zwiększyć zawartość DNA, ale pamiętać, aby nie przekraczać 50 ng DNA na ścieżkę • DNA zdegradowało. Możliwa kontaminacja nukleazami • DNA „uciekło” z żelu; przeprowadzić elektroforezę przez krótszy okres czasu, zastosować niższe napięcie, albo użyć wyższą % żelu agarozowego • użyć światło UV o krótszej długości fali (254 nm), aby znacznie zwiększyć czułość • Jeśli chcemy izolować DNA z żelu do dalszych analiz (ligacja) zastosować światło UV o długości 312 nm (zminimalizowanie degradacji DNA)

14. Diagnozowanie błędów elektroforezy agarozowej DNA • Widoczne rozmazane prążki DNA • DNA zdegradowało. Możliwa kontaminacja nukleazami • nałożono za dużo DNA na żel. Zmniejszyć ilość DNA • udoskonalić warunki elektroforezy; nie przykładać napięcia powyżej 20 V/cm • W czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniżej 30ºC • Skontrolować, czy bufor do elektroforezy ma wystarczającą pojemność buforową (sprawdzić pH buforu przy anodzie i katodzie) • nadmiar soli w DNA. Zastosować precypitację etanolem przed elektroforezą, w celu usunięcia nadmiaru soli • zanieczyszczenie DNA białkiem. Zastosować ekstrakcje fenolem, przed elektroforezą, w celu usunięcia nadmiaru białka

15. Diagnozowanie błędów elektroforezy agarozowej DNA • Jeśli obserwujemy nieprawidłową migrację prążków • udoskonalić warunki elektroforezy; nie przykładać napięcia powyżej 20 V/cm • W czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniżej 30ºC • Skontrolować czy bufor do elektroforezy ma wystarczającą pojemność buforową (sprawdzić pH buforu przy anodzie i katodzie) • DNA zdenaturowało. Nie ogrzewać wzorców masowych przed elektroforezą (z wyjątkiem DNA faga lambda/HindIII – rycina 3) • Rozpuścić wzorce masowe w buforze z 20mM NaCl

16. Rycina: Wpływ siły jonowej na denaturację cieplną fragmentów DNA faga lambda po trawieniu HindIII. Fragmenty w ilości 500ng w środowisku NaCl o stężeniu 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30, i 40 mM rozdzielone elektroforetycznie po wcześniejszym ogrzaniu w temp. 65ºC/10 minut.