“Targeting of Aberrant mRNAs to Cytoplasmic Processing Bodies”

1. “Targeting of Aberrant mRNAsto Cytoplasmic Processing Bodies” Ujwal Sheth1 and Roy Parker1,2,* 1Department of Molecular and Cellular Biology 2Howard Hughes Medical Institute University of Arizona, Tucson, AZ 85721, USA *Contact: rrparker@email.arizona.edu DOI 10.1016/j.cell.2006.04.037

2. Como se direccionan los mRNA’s con codones STOP prematuros (mutación nonsense) hacia los cuerpos de procesamiento (P-bodies) situados en el citoplasma, en el proceso llamado nonsense mediated decay (NMD).

3. Nonsense-Mediated Decay (NMD) • Las células eucariotas contienen un mecanismo de control de calidad que reconoce y degrada mRNAs aberrantes. • Un codón prematuro de terminación (PTC) produciría desordenes genéticos hereditarios en ausencia de la vía NMD. Es por ello que, NMD lo identifica y elimina ese mRNA.

4. Posibles destinos de PTC-mRNA NMD

5. En trabajos anteriores : se identificaron proteínas que forman parte de la maquinaria: upf1, upf2, y upf3 en levaduras. Luego se encontraron también en humanos: Human Upf Proteins in NMD Guramrit Singh and Jens Lykke-Andersen* Donde se determinó que son fundamentales para la degradación del mRNA. Además se observó una relación entre el NMD y el Exon-junction complex en mamíferos.

7. En NMD en primer lugar ocurre una represión traduccional. • Los procesos involucrados en la degradación son: aumento de la tasa de deadenilacion, decapping y a veces clivado endonucleotico. • Se identificaron proteínas asociadas al decapping (dcp1, dcp2), activadores de decapping (Dhh1p, pat1p, Lsm1-7p), 5’-3’ exonucleasa (Xrn1p).

8. Se observo que estas proteínas en ocasiones se encuentran juntas en ciertos lugares del citoplasma formando cuerpos dinámicos (P-bodies), unidas a mRNA (mRNP). • Dado que los mRNA deben entrar y salir de los p-bodies, el tamaño y el numero de estos sería una función de la actividad de degradación del mRNA.

9. METODOLOGIA

10. Usaron cepas de levaduras wt y otras con diferentes mutaciones en los genes de las proteínas involucradas en el proceso. Se crecieron en medio sintético con un 2% de dextrosa, a 30ºC y se observaron por microscopia confocal.

11. Experimentos de colocalizacion: Se introdujo un plasmido que expresa una proteína de fusión Dcp2p-RFP (fluorescencia roja) junto con un plasmido que expresa las proteínas Upf fusionadas a GFP (verde).

12. Marcación del mRNA

13. Transcriptional pulse-chase: Se induce la transcripción por algún tipo de estimulo y luego se interrumpe abruptamente. Sirve para observar la degradación del mensajero. • Polisome analysis: • Es una técnica que permite observar la formación de polisomas. Tiempo desde que se corto la transcripcion

14. Cuantificación P-body Se observaron un total de 75 células. Se observo el área y numero de p-bodies en cada caso. Se utilizo el programa Image J. Se evaluaron los datos por el test de student.

15. Los trabajos anteriores determinaron que upf1-3 estan involucrados en el proceso NMD. Este trabajo pretende determinar la presencia de upf1-3 en los cuerpos de procesamiento (P-bodies), lo que implicaría la ocurrencia de NMD en los P-bodies.

16. Resultados

17. Para ello usan Upf´s marcadas Dcp1∆= incapaz de realizar decapping.

19. =>Entonces las upf se acumulan cuando el decapping es bloqueado. =>¿Se acumulan en el mismo sitio donde las proteinas que hacen decapping ejercen su acción? => Experimentos de colocalización

21. Dcp1 y Dcp2 son enzimas efectoras del decapping tanto para el normal como para el PTC-mRNA (aberrante). ¿Cual de estos dos tipos de mRNA se procesa en los p-bodies?

22. Cepa Lsm1∆: defectuosa para realizar decapping en mRNA NORMALES.

23. Dhh1p: activador de decapping en mRNA normales y aberrantes.

24. Resultados similares se obtuvieron para Upf2-GFP y Upf3-GFP • Estos resultados indican que la acumulación de las proteínas Upf´s en los P-bodies es debido a un defecto en el NMD, e implica que el NMD direcciona los PTC-mRNA hacia los P-bodies. • Sin embargo, hay proteínas en los p-bodies que son capaces de activar el decapping en mRNA normales.

25. ¿El NMD direcciona los mRNA a los P-bodies?

27. Colocalización con Dcp2p-RFP

28. Upf1p se requiere para el direccionamiento de los PTC-mRNA a los p-bodies. • La upf2p y Upf3p afecta la eficiencia con la cual la Upf1 actua. • Las 3 son necesarias para el rapido procesamiento de los PTC-mRNA.

29. ¿La acción de Upf1p es anterior a la de upf2p y upf3p en el mecanismo NMD ? Se examinó cada Upf, usando Dcp2p-GFP para cada mutante Upf

30. La acumulación de Dcp2p en mutantes Upf2Δy Upf3Δ es dependiente de Upf1

31. dcp2penzimas efectoras del decapping Xrn1exonucleasas 5´---3´dhh1p, Pat1p y lsm1pactivadores del decaping Localización de:

33. Todas se acumularon en las mutantes Upf2 y Upf3

34. Estos resultados sugieren • Cuando Upf1 direcciona a un mensajero para ensamblar al P-bodie recluta enzimas que formaran parte del complejo de degradación del mensajero.

35. Interdependencia de las Upfs Solo encuentran acumulación de Upf1 en mutantes Upf2Δ y Upf3Δ

37. Upf1 actua antes e independientemente de Upf2 y Upf3 • Upf2 y Upf3 son requeridas para degradar el mensajero despues del direccionamiento • La acumulación de Upf 2 y Upf3 es interdependiente

38. Upf1p • Direcciona los PTC-mRNA a los P-bodies. • Es una 5´----3´ ATP dependiente RNA helicasa.

39. ¿En que paso interviene la actividad ATPasa? • Posibilidades: • Que intervenga en el direccionamiento • Que actue despues del direccionamiento

40. Construccion • Se expresaron WT Upf1p y DE572AA, un alelo de la Upf1 ATPasa defectuosa, en un plasmido de bajo número de copias en cepas upf1Δ. Se midió la acumulación se Dcp2p-GFP.

41. La actividad ATPasa no es necesaria para el direccionamiento de los mRNA. En cambio podría promover un rearreglo de los mRNP activando la degradación.

42. Sobreexpresión de DE572AA en cepas WT con: • Upf1p-GFP • Upf2p-GFP • Upf3p-GFP • Dhh1p-GFP • Pat1p-GFP • Lsm1p-GFP

45. La acumulación de P-bodies en cepas sobreexpresando DE572AA es independiente de Upf2p y de Upf3p

46. A diferencia de la Upf1p, las Upf2p y Upf3p no se localizaron en los P-bodies en cepas sobreexpresando WT Upf1p o el alelo DE572AA. • Esto indicaria: Que el alelo DE572AA pudo haber perdido la capacidad de reclutar la Upf2p y Upf3p O que la Upf2p y la Upf3p se asociarian al mRNP despues de la hidrólisis del ATP

47. ¿Puede la Upf1p direccionar los mRNA normales a los P-bodies?

48. Tanto los PTC-mRNA como los mRNA wt se acumulan en P-bodies cuando se expresa el alelo DE572AA, indicando que la Upf1p también direccionaría mRNA normales a los P-bodies.

49. ¿La actividad ATPasa de la Upf1p es requerida para la degradación de los mRNA normales o para liberación y reincorporación a la traducción?

50. Transcriptional pulse-chase analysis • La actividad ATPasa de la Upf1p seria requerida para la liberación de los mRNA normales que fueron direccionados a los P-bodies.