Diversité et étude des métabolismes microbiens de l’arsenic d’un ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68)

1. Diversité et étude des métabolismes microbiens de l’arsenic d’un ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68) LaboratoireInteraction Ecotoxicologie Biodiversité Ecosystèmes LIEBE UMR 7146 GDR 2909: Métabolisme de l’arsenic chez les Procaryotes Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

2. As III As V As V Pst Aqp Pit Phosphorylation SH Toxicité de l’arsenic 2 formes solubles prédominantes: As (III) ou arsénite et As (V) ou arséniate As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que l’As (V)

3. Les métabolismes bactériens influencent le statut Redox de l’arsenic • Métabolismes énergétiques • - Réduction dissimilatrice: As (V)= accepteur final d’e- en anaérobie gènes arr • - Oxydation de l’arsenic: As (III) donneur d’e-  gènes aox/ aro/ aso • Métabolismes de résistance et de tolérance • - Méthylation de l’arsenic: production d’espèces généralement moins toxiques dont certaines volatiles  gènes ars M • - Oxydation de l’arsenic: As (III) est oxydé en As (V)  gènes aox • - Réduction expulsion: As(V) réduit en As (III) (gène ars C) puis sortie de l’As (III) par une pompe spécifique (ars B et analogues)

4. Métabolismes de détoxification Réduction / expulsion Oxydation Illustrations: Silver et Phung,2005

5. But de l’étude: Comprendre le rôle des microorganismes dans la spéciation de l’arsenic en milieu faiblement contaminé. Etude de la diversité des microorganismes capables de métaboliser l’arsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines qui présente des conditions moins extrêmes que des sites précédemment étudiés comme Carnoulès. Hypothèse: diversité taxonomique et fonctionnelle plus élevée.

6. Site d’étude: Sainte Marie aux Mines, 68. • pH 6,9 / Carnoulès pH ≤ 3 • Concentration en arsenic dans l’eau 6 – 23 µg/L / Carnoulès 350 mg/L • Concentration dans le sédiment 320 - 737 mg/kg • Concentration moyenne fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg) • Contamination en Aluminium (15150 mg/kg) et en Fer (23745 mg/kg)

7. Démarche expérimentale Prélèvement du sédiment Isolement souches cultivables Extraction ADN total Etude de la diversité taxonomique bactérienne par amplification PCR de l’ADNr 16S bactérien Etude de la diversité archéale par amplification de l’ADN r 16S archée Etude de la diversité fonctionnelle par amplification gènes aox et transporteurs

8. Résultats: Diversité taxonomique • Diversité bactérienne des isolats cultivable • Diversité bactérienne totale • Diversité archéale

9. Diversité bactérienne des isolats cultivables 212 isolats 157 isolats aérobies 55 isolats anaérobies

10. Diversité bactérienne totale (248 clones séquencés) • Carnoulès dominance des Betaproteobactéries (38%) et Gammaproteobactéries ( 23%) et Acidobactéries seulement 3% (Thèse Giloteaux, 2009)

11. Diversité archéale (83 clones séquencés) • Diversité significative d’Archées • A Carnoulès uniquement Euryarchaeota amplifiés à partir d’échantillons d’eau (Bruneel et al., 2008)

12. Résultats: Diversité fonctionnelle • Répartition des gènes fonctionnels chez les isolats  Gènes de transporteurs + gènes aox • Diversité totale des gènes aox  Alignement des séquences des souches cultivables + clones

13. Répartition des gènes fonctionnels dans les isolats Transporteurs d’arsénite Oxydation acr3(2)- 11 isolats aox- 22 isolats arsB- 59 isolats acr3(1)- 75 isolats Analyse croisée Aucun gène de résistance: 38 1 gène de résistance: 100 2 gènes de résistance: 26 3 gènes de résistance: 7 A déterminer: 41

14. Diversité des gènes aox • Pas de gène aox affilié aux archées • Pas d’aox affiliés aux Gammaproteobactéries amplifiés à partir du sédiment • Présence de clones sans représentants cultivables associés • Présence chez Gram + et Flavobactéries • Possibilité de transferts horizontaux (souches soulignées)

15. Conclusionet perspectives • Mise en évidence dans le milieu d’organismes capables de réduire/ oxyder l’arsenic. • Recherche des gènes arr (respiration) et ars M (méthylation) • Réalisation de microcosmes abiotiques ou avec un inoculum bactérien contrôlé ou naturel sous différentes conditions : • Différentes phase minérale • pH • Statuts redox • As (III)/As (V) • Donneur/ Accepteur d’e- •  Suivi de l’expression des gènes fonctionnels et de la spéciation de l’arsenic

16. Merci de votre attention Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

17. Physicochimie du site: (eau et sédiments) • pH (6,9) proche de la neutralité (diffère par rapport aux autres sites d’études) • Concentration en arsenic faible dans l’eau (6 µg/L) et modérée dans sédiment (320 mg/kg) mais plus élevée que la concentration moyenne provenant du fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg). • Contamination en Aluminium et en Fer non négligeable dans sédiments.

18. Résultat de diversité des gènes de transport d’arsénite • Pas de gènes d’Archées amplifiés alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. acr3(2) ars B acr3(1) • Divisé en deux clusters: • Premier cluster: Actinobactéries (clones et isolats) et Gemmatimonadetes (clones). • Second cluster: Bacteroidetes (isolats), Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries. • Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés. • Même si phylogénie respectée par rapport au 16S cas de transferts horizontaux • 2 clusters: le premier associé aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones). • Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes. • Séquences ars B clonées et isolatsphylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries • Mise en évidence par clonage de nouveaux groupes sans représentants cultivables • Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés.

19. Diversité des gènes arsB • Séquences ars B clonées proviennent des mêmes groupes que les isolats porteurs de arsB phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries • Mise en évidence de nouveaux groupes sans représentants cultivables par clonage • Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés. • Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries BetaproteobactériesGammaproteobactériesBacteroidetes

20. Diversité des gènes acr3(1) (1/2) Actinobactéries Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries BetaproteobactériesGammaproteobactériesBacteroidetes • Divisé en deux clusters: ici est représenté le premier qui comprend les Actinobactéries et les Gemmatimonadetes (clones). • Transferts horizontaux à des Gammaproteobactéries, Betaproteobactéries et Flavobactéries.

21. Diversité des gènes acr3(1) (2/2) • Second cluster, comprenant les Bacteroidetes, Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries. • Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés. • Cas de transferts horizontaux • Phylogénie conservée par rapport au 16S. • Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Bacteroidetes Verrucomicrobia Cloroflexi- Deltaproteobactéries Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries BetaproteobactériesGammaproteobactériesBacteroidetes Gammaproteobactéries

22. Diversité des gènes acr3(2) • 2 clusters: le premier composé des acr3(2) associés aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones). • Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes. • Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Proteobactéries Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries BetaproteobactériesGammaproteobactériesBacteroidetes Verrucomicrobia