1 / 46

Hmotnostní spektrometrie (2)

Hmotnostní spektrometrie (2). Josef Chudoba. Využití MS - kvalitativní analýza. Electron Impact ionizace (EI + 70 eV) Databáze spekter GC/MS LC/MS MS/MS experimenty. Využití MS - kvantitativní analýza. Kalibrace technikou s vnitřním standardem. Úprava vzorků pro MS analýzy.

alain
Download Presentation

Hmotnostní spektrometrie (2)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Hmotnostní spektrometrie (2) Josef Chudoba

  2. Využití MS - kvalitativní analýza Electron Impact ionizace (EI + 70 eV) Databáze spekter GC/MS LC/MS MS/MS experimenty Využití MS - kvantitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Úprava vzorků pro MS analýzy SPE, SPME, extrakce ……. Speciální aplikace MS ICP-MS, Isotope Ratio MS

  3. Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Ionty vznikají interakcí molekuly s proudem elektronů o definované energii (70 eV) Molekulový ion – lichý počet počet elektronů Ionizační energie (IE) – energie nutná k odtržení elektronu z molekuly Neutrální molekula – sudý počet elektronů

  4. Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Molekulový ion informace o hmotnosti popř. chemickém složení látky, ion s lichým počtem elektronů, jeho m/z nejvyšší v MS spektru (mimo ionty izotopických příspěvků a pozadí); v MS spektru existují také nižší fragmenty s m/z molekulového iontu zmenšenou o logickou ztrátu neutrálních molekul a fragmentů Povolené ztráty m/z Zakázané ztráty m/z 4 - 14, 21 - 25 15  CH3-18 H2O28 C2H4 nebo CO35 Cl36 HCl Jsou-li přítomny tyto fragmenty v MS spektru , sledovaný ion určitě není molekulární. Podle intenzity izotopických fragmentů lze poznat přítomnost Cl, Br, lze zjistit počet atomů uhlíku fragmentu R+DB musí být celé číslo (R+DB = C -1/2 H + 1/2N +1)

  5. Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Fragmentace molekulového iontu a dalších vzniklých iontů Homolytické štěpení Heterolytické štěpení Přesmyky

  6. Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Fragmentace EI+ 70 eV 120 – 91 = 29 Ztráta neutrální částice (molekuly nebo radikálu) z rozdílů hmot píků se získajítzv. neutrální ztráty  vypovídají o struktuře molekuly

  7. Běžné neutrální ztráty EI+ (70 eV) ionizace

  8. Série nízkých iontů (1) - EI+ (70 eV) ionizace

  9. Série nízkých iontů (2) - EI+ (70 eV) ionizace

  10. EI + 70 eV: MS spektra - alkany n-dekan C4H9+ C3H7+ inkrement CH2 C5H11+ C6H13+ C7H15+ C8H17+

  11. EI+ 70 eV: MS spektra alkanů (2) n-alkan iso-alkan iso-C8 n-C8 iso-C8 n-C22

  12. EI+ 70 eV:MS spektra alkenů a cykloalkanů alkylcyklopentan alken alkylcyklohexan MS spektra alkenů jsou podobná cykloalkánům

  13. EI+70 eV: MS spektra aromátů • alkylsubstituované benzeny • chudší fragmentace  stabilní arom. kruh, fragmenty z alkylu nejintenzivnější píky  91 / 92 (tropilium) molekulový ion (toluen 92, xyleny 106, triMeBenzeny 120, atd.) butylbenzen benzen M+ 78 M+ 134

  14. EI+ 70 eV: MS spektra polyaromátů Benzo(a)pyren M+ = 252 M+/2 = 126 Benzo(b)fluoranthen M+ = 252 geometrické izomery PAU prakticky nelze rozlišit pomocí MS intenzivní molekulový iont M+ (m/z ; z=1) + 2x nabitý mol. iont (m/z ; z=2) POZOR !!! nejedná se o fragment!!!

  15. EI+ 70 eV:MS spektra alkoholů 1-hexadecanol m/z 31 1-hexadecen Alkoholy – podobná spektra jako alkeny, lze je rozlišit podle iontu m/z 31 (alkeny nemají), mají navíc velmi malý molekulový ion, nebo úplně chybí

  16. EI+70 eV: MS spektrum - aromatický alkohol molekulový ion benzylalkohol inkrement OH inkrement CH2OH m/z 109 M+1  izotop 13C fenyl+ tropylium+

  17. EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - amíny Triethylamin Anilin

  18. EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - nitrosloučeniny 2,4,6 - trinitrotoluen RDX plastická trhavina M = 222 Da

  19. EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter Univerzální komerční databáze National Institute of. NIST 05 190 825 spekter Standards and Techn (163 198 sloučenin) John Wiley & Sons Wiley Registry 8th Ed. 399 383 spekter Pallisade MS Pallisade Complete > 600 000 spekter Oborové komerční databáze John Wiley & Sons Biomarkes 1110 spekter John Wiley & SonsSteroids 2979 spekter Oborové free-ware databáze American Academy of Forensic Science (AAFS) “Comprehensive drug LIbrary “(http://www.ualberta.ca/~gjones/mslib.htm) The Int. Association of Forensic Toxicologosts (TIAFT) “Derivatives of Drugs “(http://www.tiaft.org/main/mslib.html)

  20. EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter – počítačové vyhledávání Změřené MS spektrum je porovnáváno s databázovými spektry podle různých algoritmů PBM - Probability Based Matching (McLafferty & Stauffer) – rok 1976 Dot Product (Finnigan/INCOS) – rok 1978 Mass Spectral Tree Search (Mistrik) – od roku 2000 (pro MS/MS experimenty, LC/MS aplikace) Weighted Dot Product (Stein) – od r. 1993 algoritmus součástí NIST SEARCH programu Forward search – porovnává všechny píky spektra, nejvíce podobná spektra přiřadí Reverse search – nebere v úvahu všechny píky měřeného spektra, píky, které se neshodují s přířazeným databázovým spektrem ignoruje

  21. EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Výsledkem porovnání měřeného MS spektra s databázovými je několik spekter (HITů) - o kvalitě knihovního nálezu vypovídá tzv. MATCH factor (0-999) – vyšší hodnota – lepší shoda

  22. EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!! Podobné látky mohou mít odlišná MS spektra, ale …

  23. EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!! Ale odlišné látky mohou mít i podobná MS spektra

  24. GC/MS: pomoc při identifikaci Kovatsův retenční index (RI) RI = 100n + 100[log(tx) − log(tn)] / [log(tn+1) − log(tn)] n-C16 n-C17 n … počet atomů uhlíku n-alkánu před sloučeninou X tn … retenční čas n-alkánu před sloučeninou X tn+1 … retenční čas n-alkánu za sloučeninou X tx … retenční čas sloučeniny X log .. přirozený logaritmus n-C15 n-C18 tn tn+1 n-C14 tx Hodnoty RI jsou dostupné pro celou řadu látek a podmínek – fáze GC kolony (nepolární vs polární), teplotní program separace atd. http://webbook.nist.gov/chemistry/ NIST 05 MS knihovna

  25. LC/MS: kvalitativní analýza Sprejové ionizační techniky poskytují pseudomolekulové ionty resp. adukty molekulového iontu s některými kationty (pozitivní režim) nebo anionty (negativní režim). Často vznikají při ionizaci i oligomery sloučenin nebo v ESI vícenásobně nabité ionty. Pozitivní režim Negativní režim M + 1 (H+) M - 1 ( - H+) Možné adukty Možné adukty M + 23 (Na+) M + 39 (K+) M + 32 (CH3OH) M + 41 (CH3CN) M + 22 (Na+ -H) M + 45 (COOH-) M + 59 (CH3COO-) M + 58 (NaCl) M + 41 (CH3CN)

  26. LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty Velké molekuly (ESI) – série iontů – nestejné rozdíly mezi m/z – příklad koňský myoglobin (M = 16951 Da) Určení náboje a celkové hmotnosti molekuly: m1 a m2 .. m/z dvojice sousedních iontů, n1 a n2 jejich náboj (z), X adukt k molekulovému iontu m1 = [M+n1X]/n1 m2 = [M+n2X]/n2 n2 = (m1-X)/(m2-m1) m1 = 1413, m2 = 1542, odhad X = 1 n2 = 10.94 , Mcalc = 16951 Da m1 = 1305, m2 = 1413, odhad X = 1 n2 = 12.07, Mcalc = 16944 Da

  27. LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty malé molekuly – příklad dvounásobně nabitý ion – poloviční rozdíl u m/z mezi izotopy [M+2H]2+ z = 1 z = 2 C156 H204 N8 O18 D 1 Da D 0,5 Da M = 2477,5292 Da [M+H]+ = 2478,5372Da [M+H]+

  28. kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik APCI+ [M+H] +

  29. kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik ESI+ [M+Na] +

  30. kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik EI+ 70 eV

  31. LC/MS/MS: kvalitativní analýza Lze měřit jen s IT, QqQ, nebo hybridními MS spektrometry (Q-TOF,IT-Orbitrap) 1.Separátor výběr iontu -> „definované rozbití” iontu v kolizní cele -> analýza produktů 2. analyzátorem APCI pos MS spektrum MS2 -MS/MS z [M+H]+ [M+H]+ MS3 - MS/MS z m/z 523

  32. LC/MS/MS: kvalitativní analýza Aby se rozdělily jen podle m/z muselo by být R = 740 000 C15H31N5O6Cl2 + H m/z 448,1730 C24H27NO6 + Na m/z 448,1736 Zdroj: Shimadzu LCMS-IT-TOF brochure

  33. MS: Kvantitativní analýza CÍL: • Potvrzení, že jde skutečně o sledovaný analyt • Zjištění jeho koncentrace ve vzorku Ad 1: většinou se jedná o chromatografické analýzy (GC/MS resp. LC/MS) – znám retenční čas (RT) EI+ 70 eV: TIC režim (menší citlivost) – pro identifikaci k dispozici celé MS spektrum SIM režim (vyšší citlivost) – vždy je lépe snímat alespoň dva charakteristické ionty (identifikaci může potvrdit poměr jejich odezev) ESI, APCI: MRM (Multiple Reaction Monitoring) – MS/MS technika – 1 analyzátor SIM (výběr iontu) – 2. analyzátor kolize – 3. analyzátor SIM (více iontů, sleduje se poměr odezvy)

  34. LC/MS/MS: Kvantitativní analýza Příklad využití MRM Izotopicky označený standard – stejné retenční chování, jiná molekulová hmotnost – používá se jako vnitřní standard (Internal Standard – IS) Kvalitativní informace: retenční čas a přítomnost dceřinného iontu (m/z) popř. poměr ploch píků stop více dceřiných iontů Kvantitativní informace: plocha píků dceřinného popř. dceřiných iontů (m/z) pro analyt a vniřní standard Zdroj: Agilent technologies 5989-9665 App. Note

  35. A/Ais Vnitřní standard (Plocha Ais) Analyt (Plocha A) c/cis MS: Kvantitativní analýza Kalibrační přímka c .. Koncentrace A/Ais = RRF . c/cis Směrnice přímky je RRF RRF .. Relativní odezvový faktor Kalibrace s použitím vnitřního standardu Přítomnost vnitřního standardu snižuje vliv kolísání odezvy MS detektoru, u GC chybu při nástřiku atd., jako vnitřní standard lze použít i podobnou sloučeninu ne izotopicky značenou

  36. A/Ais c/cis MS: Kvantitativní analýza Signál (signal) Kalibrační rozsah Šum (noise) LOD ~ 3 x (Anoise/Ais) / RRF LOQ~ 10 x (Anoise/Ais) / RRF Mez detekce (Limit of Detection - LOD) Mez stanovitelnosti (LOQ - Limit of Quantification)

  37. MS: Kvantitativní analýza – citlivost MS spektrometrů Specifikace výrobce: pro konkrétní sloučeninu a podmínky – udává se poměrem signál/šum pro absolutní detekované množství sloučeniny – zpravidla se jedná o množství v řádu pikogramů (pg = 10-12g) nebo femtogramů (fg = 10-15g) C10F8 GC/MS: splitless nástřik: 1 pg oktafluorunaftalenu (OFN) – SIM režim m/z 272 - S/N > X LC/MS/MS: FIA: ESI+ 100 fgreserpine MRM: m/z 609 ->m/z 397 a 447 S/N > X C33H40N2O9 Nejmenší absolutní detekované množství : SIM (MRM): řádově fg-pg TIC (Full Scan): řádově pg-ng Maximální abs. detekované množství: dané dynamickým rozsahem cca 3-5 řádů tzn. SIM(MRM) ng ;TIC (Full Scan) mg vždy však záleží na typu sloučeniny – odezva MS detektoru není univerzální

  38. Předúprava vzorků Cíl: zjednodušení matrice vzorku (odstranění interferujících sloučenin) zakoncentrování analytu ve vzorku změna rozpouštědla např. voda není vhodná pro GC/MS analýzu Způsoby předúpravy: filtrace centrifugace zakoncentrování odpařením extrakce (rozpouštědlová, Soxhlet) SPE (Solid Phase Extraction) Purge and Trap SPME (Solid Phase Microextraction) Pro těkavé sloučeniny (VOC)

  39. Předúprava vzorků: SPE – Solid Phase Extraction Vzorek (analyt s matricí) je nanesen na kondiciovanou vrstvu sorbentu. Matrice je oddělena a zakoncentrovaný analyt je eluován malým objemem vhodného rozpouštědla. Normální uspořádání fází Polární sorbent, nepolární rozpouštědlo Reverzní uspořádání fází Nepolární sorbent, polární rozpouštědlo Iontová výměna pro iontové sloučeniny

  40. Předúprava vzorků: SPME (Solid Phase Microextraction) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z plynných matricí nebo těkavých a semitěkavých sloučenin z vody Vlákno: polymerní sorbent na nosiči: Carboxen 75 mm/ Poludimethylsiloxan (PDMS) 85 mm těkavé látky Mw 30 – 225 Da PDMS 100 mm těkavé látky Mw 60 – 275 Da PDMS 30 mm semitěkavé nepolární Polyakrylát (PA) 85 mm semitěkavé polární Kompatibilita s vodnou matricí

  41. Předúprava vzorků: Purge and Trap (P-T) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z vody Vzorek je vystripován z vody proudem plynu (dusík, He) a organické látky jsou sorbovány na sorbent Sorbent je desorbován, organické látky zakoncentrovány a přeneseny na GC kolonu

  42. ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Stopová analýza prvků (kovů)

  43. ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Způsob dávkování vzorku: Kapalina: tvorba aerosolu Pevné látky: Laserová ablace

  44. ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) ICP torch – tvorba iontů

  45. ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie)

  46. ISOTOPE RATIO MASS SPECTROMETRY Využití v geologii, archeologii, kriminalistice Organická látka je katalyticky spálena na CO2 (CuO/Pt~ 800°C), voda je odstraněna přes NAFION membránu a CO2 je detekován pomocí MS (obvykle dva detektory jeden na 13 CO2 m/z 45 a druhý na 12 CO2 m/z 44) Standartní ref. látka – CaCO3 Pee Dee Belemnite (PDB) – rozkladem CO2s poměrem pPDB =13C/12C = 0,01123 d13C = 1000 * (pvzorek – pPDB)/pPDB CO2 výdech lidi USA CO2 výdech lidi Evropa Fosilní paliva CO2 atmosféra Methan atmosféra PDB Fosilní paliva

More Related