Fundamentos de PCR

1. Fundamentos de PCR Dr. José A. Cardé-Serrano Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Biol 4207 – Lab de Virologia y Biotecnologia Universidad de Puerto Rico - Aguadilla

2. Objetivos • Estudiar los pasos que componen la reacción de PCR • Discutir factores importantes en la optimización de esta técnica • Conocer Aplicaciones • Preparar una reacción de PCR e incubarla en el termociclador.

3. ADN PCR Muchas moléculas amplificación (molécula sencilla) Reacción en cadena de la polimerasa - PCR PCR es básicamente una técnica de amplificación del ADN.

4. PCR Dolan Learning Center Biology Animation Library CSHL

5. Historia 1985 – se crea la técnica molecular conocida como “PCR” Kary B. Mullis, Coorporacion CETUS Premio Nobel en Química 1993

6. Procedimiento del “PCR” • Desnaturalización • Hibridización • Extensión

7. Desnaturalización • Calor del ADN 94°C. • Filamentos dobles se derriten. • Hay una separación física de las dos cadenas.

8. Hibridización • La temperatura se reduce a 54°C. • Movimiento Browniano. • El movimiento que lleva a cabo una partícula muy pequeña que esta inmersa en un fluido • Enlaces de hidrógeno. • Filamento de ADN. • Bases construidas.

10. Extensión o Polimerización • Temperatura de polimerasas 72°C. • Los “primers” tienen una fuerte atracción al molde o templado • Los “primers” sin exacto pareo se pierden. • No dan extensiones de fragmento. • El procedimiento se repite y se forman copias del ADN.

11. LINK

12. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Cortos primers de ADN específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

13. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

14. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

15. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

16. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

17. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

18. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

19. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Primero, la fusión separa las dos cadenas de ADN a alta temperatura (~100°C)

20. Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC Fusión 95°C 2do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC Primer Ciclo Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

22. PCR LINK

23. Hay 6 componentes esenciales en el proceso de PCR • ADN polimerasa termoestable • Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) • Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) • Cationes divalentes • Buffer (para mantener el pH) • ADN molde (Templado)

24. ADN polimerasas termoestables • Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del templado. • Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C • Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta • Algunas presentan actividad transferasa terminal en el extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romos • Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades) • La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa TaqThermus aquaticus,Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis

25. Oligonucleótidos iniciadores (primers) • Se conoce su secuencia • Es el factor mas importante para la eficiencia y la especificidad del proceso • Deben estar presentes en exceso (1013 = 30 ciclos, 1 kb) • Requieren de un cuidadoso diseño • Reglas de diseño: (a) longitud = 18-25 bases (b) Contenido de G+C entre 40-60% (c) Evitar las secuencias repetidas

26. Evitar las secuencias repetidas 5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’ 5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’ 3´ repetido PCR 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ Dímero de primer

27. Evitar las secuencias repetidas 5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´ 5´-TATANNNNNNNN-3´ 3´-NNNNNNNNATAT-5´ 5´ repetido PCR 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 5´ no hay extensión

28. Evitar las secuencias repetidas 5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’ 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT Formación de horquillas PCR 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ Productos de PCR no deseados

29. ADN molde (templado) • Puede ser ssADN o dsADN (simple o doble cadena) • ADN circular y cerrado es levemente menos efectivo que el ADN lineal • Usualmente se utilizan varios miles de copias, ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg de plasmídico • Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas

30. El ciclo de PCR • Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55% • Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers • demasiado alta = poco o nada de producto • demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos • Extensión - a la temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada ej.: 72°C para Taq

31. Variantes de la PCR • Touchdown PCR • Colony PCR • Multiplex PCR • Hot start PCR • Nested PCR • Inverse PCR • Long PCR • Quantitative “real time” PCR

32. Multiplex PCR • Describe una PCR en la cual hay presentes múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa • Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico • Ahorra templado, tiempo y gastos • Requiere una cuidadosa optimización

33. Nested PCR • A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo, apareciendo un “esparcido” • Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros • Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (esparcido) • Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers

34. Nested PCR 1era PCR Esparcido de ADN 2da PCR ADN específico

35. A-3’ 3’-A A A Clonado con PCR: clonado T-A Producto de PCR a partir de Taq Vector con cola-T ligamiento Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor que ligamiento con extremos romos

36. Mutagénesis por PCR • Introduce cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN • El método de extensión solapada requiere 2 primers mutagénicos y otros 2 • Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´ que se solapan. Ambos portan la mutación • Usa los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa

37. Primer mutagénico directo (forward) Primer SP6 Primer T7 Dos 1ras PCRs separadas primer mutagénico inverso (reverse) X x remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar x x 2da PCR Mutagenesis con PCR- extension solapada

38. RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa • Para amplificar copias de cADN de ANR • Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de ANR • Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cANDs) si algo de su secuencia es conocida • Requiere primer “antisense” y un AND polimerasa dependendinte de ANR • Puede ser usada para construir bibliotecas de cAND • Primero se hace un cAND a partir del templado de ARN • Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el duplex de cAND por PCR

39. mANR (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ Transcripción reversa GSP1 (sense) AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ 1ra cadena cDNA GSP (antisense) PCR usando GSP+GSP1 GSP1 GSP RT-PCR LINK Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

40. Real Time - PCR • Alta especificidad • Usa primers marcados con moleculas fluorescentes • Resultados son no solo cualitativos sino cuantitativos • Sensitividad mucho mayor • LINK

41. Parte Práctica Amplificación de DNA de Fago λ

42. Lambda ADN • Bacteriófago Lambda (λ) • Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7 strain) • Usado como sustrato para enzimas de restricción • Peso molecular 31.5×106 daltons y genoma de 48502 pares de bases

43. Secuencia de Lambda DNA • Sanger et al. 1982 J. Mol. Biol. 162: 729-773

44. Protocolo Seguir el protocolo delineado en el “PCR AMplificatiom Kit” Cat. #R011

45. Sondas control • Sonda control 1 • 5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’ • Sonda control 2 • 5’-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3’ • Sonda control 3 • 5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’

46. ¿Preguntas?

47. Preguntas • Muy poco magnesio no produce suficiente producto de PCR y mucho produce bases pareadas erróneas, ¿por qué? • Al escoger los “primers” es importante evitar secuencias que sean complementarias entre estos, ¿por qué? • ¿Como cambiaria el producto del PCR si en vez de amplificar ADN viral se amplificara ADN bacteriano (este ADN es metilado)?

48. Asignación • Hacer un reporte con la secuencia de λ y donde en ella se pegan los primers usados. • Demostrar la complementaridad y la secuencia comprendida en la amplificación.