Diseño de bacterias para inmobilización de metales: Bio-remediación de suelos

1. Diseño de bacterias para inmobilización de metales: Bio-remediación de suelos Marc Valls y Víctor de Lorenzo

2. Abundancia Ca, Mg, Fe Mn, Cu, Co, Zn Pb, Cd, Ni, Ag, Hg Toxicidad

3. Mecanismos de toxicidad de los metales pesados - Alteración de las funciones de los metales esenciales. - Interferencia en la homeóstasis del Ca. - Permeabilización de membranas. - Efectos sobre la estructura del DNA.

4. Río Guadiamar el día después del accidente de Aznalcóllar

6. Bacterias para la bioremediación de metales pesados?

7. METALES 1 1 1 10 10 10 100 100 100 1 10 NANO MICRO MILI MOLAR Metalotioneínas Eucariotas Cianobacterias ORGANISMOS

8. Metalotioneína-2 de rata

9. 1- Mouse M D PN C S C S T GG S C T C T S S C A C K N C K C T S C K K S C C S C C P V G C S K C A Q G C V C K G AA D K C T C C A 2- Snail GE C A EP Q C K Q G C T K C T S DG C C K C T G PD S C C G S C S C K S G KG K K T S C R S C G S C C E G C A A C T N C K G E K S 3- Crab M P GP C C N D K C V C Q E GG C K A G C Q C T S C R C S P C Q K C T S G C K C A T KE E C S K T C T K P C S C C P K 4- Sea urchin C C G Q C K D G T N AA C C N G K C G G S T E GN C M P DV K C V C K E GK E A C F D C T GE C C K GT C C I C K A C S C C A C 5- Drosophila M P C P C G S G C K C A S QA T KG S C N C G S D C K C G G DK K SA C G C S E 6- C. elegans V C K C D C K N QN C S C N T GT K D C D C S D AK C C E Q Y C C P T AS E KK C C K S G C A G G C K C A N C E C A Q AA H 7- Tetrahymena K V NN N C C C G E NA K P C C T D PN S G C C C V S ET N N C C K S DK K E C C T G TG E G C K C T G C K C C Q P AK S G C C C G D KA K A C C T D PN S G C C C S S KT N K C C D S TN K TE C K T C E C C K 8- Neurospora G D C G C S G AS S C N C G S G C S C S N C G S K A N D C K C P N G C S C P N C A N GG C Q C G D K C E C K K QS C H G C G E Q C K C G S H G S S C H G S C G C G D K C E C K 9- Candida P E QV N C Q Y D C H C S N C A C E N T C N C C A K PA C A C T N SA S NE C S C Q T C K C Q T C K C 10- Candida M E F T T AM F G T SL I F T T ST Q SK H N L VN N C C C S S ST S ES S MP A S C A C T K C G C K T C K C 11- Yarrowia M F S E LI N F Q N EG H E C Q C Q C G S C K N NE Q C Q K S C S C P T G C N S DD K C P C G N KS E ET K KS C C S G K 12- Saccharomyces M T VK I C D C E G E C C K D S C H C G S T C L P S C S G GE K C K C D H S T GS P Q C K S C G E K C K C E T T C T C E K SK C N C E K C 13- Saccharomyces T S TT L VK C A C E P C L C N V DP S KA I DR N GL Y Y C S E A C A D G H T G GS K G C G H T G C N C H G 14- Cianobacteria M S G C G C G S S C N C G D S C K C N K RS S GL S Y S E ME T TE T VI L GV G PA K IQ F E G AE M SA A SE D GG C K C G D N C T C D P C N C K 15- Pea

10. MT MT Alb. CdMT Cd2+ CdAlb. CdMT CdMT Cd2+ Cd2+ Hígado Riñón Intestino, pulmones CdMT

11. 1 1 1 10 10 10 100 100 100 1 10 NANO MICRO MILI MOLAR Exportación, reducción Gram-positivas Quimiolitótrofos Gram-negativas E. coli Alcaligenes sp. METALES Metalotioneínas Eucariotas Cianobacterias ORGANISMOS

13. Sistemas de expresión de metalotioneínas en la superficie de E. coli

14. Envuelta de gram-negativas Membrana externa Espacio periplásmico Peptidoglicano Membrana interna

15. 2. OM 3. 4. OM 2. LamB-MT 3. MT-IgAb 4. MT-PAL Peptidoglicano 1. OM 1. Lpp-OmpA-MT

16. IgA proteasa de Neisseria ME Periplasma MI Citoplasma

17. M2+ medio Periplasma C MT E-Tag Plac Leader IgA

18. KDa 200 97.4 66.2 45.0 31.0 Fraccionamiento de E. coli pMtb Soluble MI ME wt Dsba- wt Dsba- wt Dsba-

19. KDa 200 97.4 66.2 45.0 31.0 Localización de MT-IgAen E. coli Soluble MI ME wt Dsba- wt Dsba- wt Dsba-

20. Y Y Y Y Y Y Y Y Y ELISA sobre células 1 2 3 Intacta Choque osmótico Lisada Superficie Superficie + periplasma Proteína total

21. 3 Exposición en la superficie 2 DO492 1 1- Superficie 2- Superficie + periplasma 3- Proteína total 0 + + - pMt Estirpe WT WT Dsba-

22. 15 10 Bioacumulación de Cd2+ en E. coli nmoles Cd2+/mg 5 0 + + - pMt Estirpe WT WT Dsba-

23. Problemas Soluciones - Las cepas de laboratorio son inadecuadas. - Usar estirpes del suelo. - E. coli es sensible a los metales. - Usar bacterias resistentes a metales. - Se requiere selección para mantener los genes - Integrar los genes en el cromosoma. - Inducción con IPTG - Inducir con aromáticos.

24. Expresión de metalotioneínas en bacterias del suelo (Ralstonia eutropha)

25. Estructura del transposón Tn5-MT Km XylS Pm MT I O 1 Kb

26. Ralstonia sp. Pseudomonas sp. Transposición de TnMT Escherichia coli

27. Ralstonia sp. Pseudomonas sp. Transposición de TnMT

28. Expresión de MT-IgA en R. eutropha - + + + TnMT - - - - + + + + 3-MB KDa 66.2 55.0 42.7 40.0 30.1

29. Sol. MI ME Sol. MI ME Sol. MI ME Localización de MT-IgA en R. eutropha + + - TnMT KDa 97.4 66.2 55.0 42.7 40.0

30. 300 M 45 30 15 0 + - E. coli R. eutropha 30 M 30 30 nmoles Cd2+/mg 15 15 0 0 + + - - MT

31. Ralstonia eutropha MTb

32. Nice but… does it work in polluted soil?

33. 1 2 3 Inmobilización de Cd2+ en el suelo Suelo estéril +Ralstonia wt +Ralstonia MT

34. 1 2 3 Suelo estéril +Ralstonia wt +Ralstonia MT

35. Efecto de R. eutropha sobre el crecimiento vegetal 15 3 2,5 2 1,5 1 Peso seco (g) 0,5 Clorofila (mg/g) 0 Estéril +Cd2+ WT +Cd2+ MT +Cd2+ Control (sin Cd2+)

36. Inmobilización de Cd2+ en suelo 1- Suelo estéril 2- + Ralstonia wt 3- + Ralstonia MT 1 2 3