Fraccionamento celular e cultura de células

1. Fraccionamento celular e cultura de células

2. Células do SI(vulgarmente isoladas) • Eritrócitos • Plaquetas • Polimorfonucleados (PMNs) • Macrófagos • NK • Linfócitos B e T - imunidade humoral e celular

3. Separação de células sanguíneasCentrifugação em gradiente • Envolve a separação de partículas com base na sua massa e forma numa solução de densidade e/ou concentração decrescente • A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação migra de acordo com a sua velocidade e sedimentação, ex: gradiente de Ficoll-Hypaque

4. Separação de células sanguíneasCentrifugação em gradiente Eritrócitos+ PMNs - mais densos Células mononucleares (linfócitos/ monócitos)-menos densos: recuperados à superfície

5. Separação de células sanguíneasCentrifugação em gradiente Análises Clínicas (Linfócitos) • Colheita + Heparina • Decantar sobre tubo com um gradiente de Ficoll- Hypaque. • O gradiente é formado por uma mistura de soluções de concentrações progressivamente crescentes que se distribuem ao longo do tubo de centrífuga, ficando as soluções de maior densidade no fundo • Coloca-se a amostra de sangue heparinizado sobre o gradiente e centrifuga-se. As células distribuem-se em camadas distintas ao longo do gradiente, de acordo com a sua densidade.

6. Análises Clínicas (Linfócitos) • O Ficoll possui uma densidade maior que a dos linfócitos mas menor que os glóbulos vermelhos e granulócitos; após centrifugação os glóbulos vermelhos e os PMNs passam pelo Ficoll formando um pellet no fim do tubo. • Os linfócitos ficam na interface do meio e do Ficoll • A camada correspondente aos linfócitos e algumas células mononucleares- anel branco - pode ser aspirada.

7. Separação de células sanguíneasPanning • Aderência celular a uma superfície sólida

8. Separação de linfócitos por PanningAnálises Clínicas (Linfócitos) • Técnica usada no isolamento de subpopulações de linfócitos, em que estes podem aderir á superfície se esta estiver coberta com os anticorpos apropriados • Método eficaz na separação Th de Tc usando anticorpos CD4+ e CD8+ • Eficaz também na separação de linfócitos T e B usando anti-Igs

9. Separação de células sanguíneasSeparação imunomagnética • Acoplamento de esferas magnéticas a anticorpos monoclonais que reconhecem moléculas da superfície das células • Os anticorpos acoplados ás esferas magnéticas, são misturados com as células a separar;a mistura passa por uma coluna magnética, que retêm as células ligadas ao anticorpo.

10. Separação de células sanguíneasSeparação imunomagnética

11. Separação de células sanguíneas(Linfócitos, ...................) • Centrifugação • Panning • Separação imunomagnética • Cromatografia de afinidade • Citometria de Fluxo • FACS ( fluorescence- activated cell sorter)

12. Separação de células sanguíneas(Linfócitos, ...................) • O isolamento de de linfócitos é um passo fundamental na avaliação qualitativa e quantitativa da imunidade celular • Em análises clínicas estes estudos centram-se na caracterização de defeitos primários ou adquiridos da imunidade: • quantitativamente podemos totalizar e diferenciar o nº de células representantes das populações linfocitárias • qualitativamente podemos caracterizar funcionalmente estas células e avaliar a sua capacidade efectora

13. CULTURA DE CÉLULAS

14. APLICAÇÕES • Estudos imunológicos • Resposta celular in vitro • Migração celular • Estudos de sensibilidade a drogas • Citotoxicidade • Adesão celular • Proliferação celular

15. Requisitos das culturas celulares Como se processa?É necessário mimetizar as condições fisiológicas • Meio de cultura apropriado: • - Soro e nutrientes • - Factores de crescimento • Antibióticos • Atmosfera adequada • Superfície de adesão

16. Meio de cultura apropriado • SORO e NUTRIENTES • Soro, a parte não celular do sangue, contém centenas de proteínas e factores necessários ao crescimento celular: • - Insulina, Transferrina e Proteínas transportadoras de ferro; • Vitaminas • Biotina, Folatos, Tiamina, riboflavina, ácido pantoténico,etc • Sais • NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 • Glucose • Exs de meios comerciais : PBS,DMEM,RPMI,Iscove`s

17. Culturas primárias • Derivam directamente dos tecidos ou orgãos (pele, rim, fígado) Estes devem ser obtidos em condições assépticas e levados ao laboratório rapidamente, imersos em meio de cultura, para manutenção da viabilidade celular. • Ponto de partida para linhas celulares contínuas • resultam da selecção, de culturas primárias, de clones capazes de sobreviver e de se multiplicar (50 gerações) • estes clones (qq população de células descendentes de uma célula única ancestral) originam linhas celulares diplóides ou aneuplóides

18. Linhas Celulares Imortais • Têm origem em células tumorais, que sofreram transformações oncogénicas. Não só crescem indefinidamente em cultura, mas também o fazem máis rapidamente, duplicando o seu nº em menos de 24 horas. • Apesar da sua proveniência tumoral mantem as propriedades básicas celulares, o que permite ao imunologista a transferência de genes no intuito de investigar a sua função e regulação. • Ex: • Infecção por vírus • - HTLV-1 - para células T • - EBV - para células B