BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓN

1. BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓN Introducción Mecanismos de evolución y adaptación Ejemplos

2. PROCARIOTAS en la biosfera • Hay de 4-6 x 1030 células de procariotas • Su biomasa es muy superior a la biomasa de eucariotas • 90% de los procariotas se encuentran en el SUBSUELO • 10% en SUELOS, SEDIMENTOS, MASAS DE AGUA, AIRE, EUCARIOTAS • Mucha BIODIVERSIDAD • Estimación del nº de especies bacterianas: entre 10.000 y > 1 billón (109) • Existen desde hace cerca de 3,5 G-años (las plantas existen desde hace 600 millones de años)

3. Formación de la tierra Homo sapiens Caballo Estabilización de la corteza Atmósfera de oxígeno Dinosaurios procariotas Trilobites 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Billones de años Woese, 1994 • Sin embargo, sólo unas 6000 especies descritas, frente a más de 1 millón entre animales y plantas, o ca. 1 millón de especies de insectos. ¿PORQUÉ?Pequeños, simples, dificultad cultivo puro, pocos estudios taxonómicos, ...

4. Número de procariotas en habitats acuáticos • Hábitat Volumen, Celulas/ml Nº total de celulas • cm3× 105× 1026 • Marino • Plataforma continental 2.03 × 1020 5 1.0 • Océano abierto • Agua, por encima de 200 m 7.2 × 1022 5 360 • Agua, por debajo de 200 m 1.3 × 1024 0.5 650 • Sedimento, 0-10 cm 3.6 × 1019 4600 170 • Dulce • Lagos 1.25 × 1020 10 1.3 • Rios 1.2 × 1018 10 0.012 • Lagos salinos 1.04 × 1020 10 1.0 • Total 1180 x 1026 Whitman et al., 1998

5. Número de procariotas en el suelo Tipo de ecosistema Area, No. of cells, × 1012 m2 × 1027 Selva tropical lluviosa 17.0 1.0 Selva tropical pluviestacional 7.5 0.5 Bosque templado esclerófilo 5.0 0.3 Bosque templado caducifolio 7.0 0.4 Bosque boreal (taiga) 12.0 0.6 Bosques y arbustedas 8.0 28.1 Sabana 15.0 52.7 Praderas templadas 9.0 31.6 Matorral desértico 18.0 63.2 Tierras cultivadas 14.0 49.1 Tundra y vegetación alpina 8.0 20.8 Pantanos y zonas húmedas 2.0 7.3 Total 123.0 255.6 x 1027

6. Número total de procariotas en sedimentos subsuperficiales no consolidados (por debajo de 10 m) Nº de células, × 1028 Intervalos de Cells/cm3 Océanos Plataforma Planicies profundidad (m) × 106 profundos continental costeras 0.1 220.0 66.0 14.5 4.4 10 45.0 121.5 26.6 8.1 100 6.2 18.6 4.1 1.2 200 19.0 57.0 12.5 3.8 300 4.0 12.0 2.6 0.8 400 7.8 10.1 3.2 600 0.95 3.7 1.2 1200 0.61 3.2 1.0 2000 0.44 2.6 0.9 3000 0.34 0.7 Total 275.1 79.9 25.3 Grand Total: 380 × 1028=3.8 × 1030

7. APROXIMACIONES AL ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD BACTERIANA ¿Quién está ahí? CULTIVOS (puros) ESTUDIO DE COMUNIDADES OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO CULTIVOS (puros) Estudios fenotípicos: muy limitados Secuencias  grandes cambios en la taxonomía bacteriana %GC 16S  Árboles filogenéticos Análisis de fosfolípidos u otros marcadores Inconvenientes: Hay que cultivar! (VNC) Es posible que sólo detectemos el 1% de los presentes < 5000 especies en colecciones

8. ESTUDIO DE COMUNIDADES Métodos moleculares: aislamiento de ADN total PCR + clonación Análisis de secuencias conservadas (16S) Inconvenientes: Información de secuencia 16S puede NO ser suficiente para delimitar especies < 5000 secuencias de ARNr 16S en bases de datos OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO Muestras fijadas Tinción general Inconvenientes: Información sobre ABUNDANCIA de microorganismos. NO sobre tipos Tinción específica (sondas)  controles muy difíciles Se recomienda utilizar una combinación de todas las aproximaciones.

9. VIABLES PERO NO CULTIVABLES • Microorganismos presentes en la naturaleza pero que NO somos capaces de cultivar en el laboratorio. • V. cholerae en habitats “puros” incubadas en agua de mar artificial, permanecían viables pero PERDÍAN la capacidad de formar colonias en medios de cultivo • Muchas especies pueden alcanzar un estado de VIABLE, NO CULTIVABLE • Fallan los medios de cultivo. ¿Por qué? • “Desacoplamiento” entre metabolismo y división celular (daño oxidativo) • (atracón) • (suicidio microbiológico) • SOLUCIÓN: cultivos con restricciones nutricionales

10. Biodiversidad y biodegradación de aromáticos ¿Por qué existen bacterias capaces de degradar tolueno y otros compuestos aromáticos, incluso xenobióticos? ¿Cómo son? ¿Cómo se originan?

11. Lignina

12. C O O H O H O H p r o t o c a t e c u a t o C H 3 O H O H 3 - m e t i l c a t e c o l C O O H C O O H O H O H O H O H p r o t o c a t e c u a t o Meter aquí transparencia 15 de Biodiversidad vamos a hablar de dioxigenasas del anillo

13. c a t D F I C B M A b e n D C B A N B A M C H I K Q J F G E T L Z Y X x y l R S b d A B C n a h A a n d o A B C b p h A 1 A 2 A 3 A 4 B C E G F D I S P a I S P ß F d R a s a t c b A a A b A c A d B I S I S F d t c b F E D C R D H D H c b a A B C I S I S R a s a C 2 , 3 O c DIOXIGENASA DEL ANILLO Van der Meer, 1997

14. Generalidades-Conclusiones Patrones muy conservados de organización cromosómicas de las rutas, aunque se observan reorganizaciones. Flanqueadas por secuencias de inserción en algunos casos. La mayoría son operones. La mayoría están reguladas. En muchos casos se puede predecir la ruta por les genes presentes.

15. Capacidad biodegradadora Mancha alquitrán Aguas subterráneas 100 U COOH U Carretera 50 D D % Mineralización L Toma de muestra f e n a n t r e n o L D OH p-HB 50 m U D U L L 0 p-HB NAF FEN n a f t a l e n o Abundancia microbiológica 109 D L U 106 U Log cfu D D L 103 U L 0 viables totales protozoos ¿Ocurre Biodegradación en la naturaleza? (Madsen et al., 1991)  Se ha producido una adaptación de las poblaciones autóctonas a hidrocarburos poliaromáticos  Ha habido crecimiento estimulado por el contaminante

16. Evolución natural: RESPUESTA ADAPTATIVA • Con frecuencia, se observa: • Compuesto xenobiótico • Comunidad microbiana incapaz de degradarlo. Incubación en presencia del compuesto • Pasado un tiempo, se produce mineralización total del compuesto. • Ha habido un CAMBIO en la comunidad bacteriana • MECANISMOS POSIBLES: • inducción de enzimas • crecimiento de una subpoblación de la comunidad • SELECCIÓN de una subpoblación con propiedades nuevas (adaptación genética) Lleva más tiempo No es reproducible

17. MECANISMOS NATURALES DE EVOLUCIÓN • Mutación /Selección • Mutaciones ocurren AL AZAR • El medio selecciona las favorables. • Mutaciones puntuales • Ocurren al azar, constantemente (dependen de la tasa de crecimiento) • Cambio de una base en el ADN • Recombinación y transposición • Pueden producir reorganización genética. • Duplicaciones. • (de uno o varios genes, generalmente por recombinación o slippage) • Suponen grandes ventajas • Elementos de inserción • Pueden tener consecuencias varias • Transferencia genética • Paso de ADN de una bacteria a otra

18. Mutaciones puntuales • mutaciones silenciosas (se acumulan). • mutaciones con efecto fenotípico (numerosos ejemplos en el laboratorio) • Son la fuente principal de biodiversidad. • ATG TTC GGA GGC ACC TTG.... . Gly: GGN • Met Phe Gly Gly Thr Leu ...... Proteína APhe: TTC, TTT • Leu: TTG, TTA • ATG TTC GGT GGC TTG.... . ATG TTA GGA GGC TTG.... . • Met Phe Gly Gly Leu ......MetLeuGly Gly Leu ...... • Proteína A* b e n D C B A Mutación silenciosa Mutación no silenciosa b p h A 1 A 2 A 3 A 4 B C E G F D • Recombinación y transposición • Se observa en rutas conocidas.

19. Duplicaciones. • Se observan con frecuencia • Mecanismo importante de evolución: no se pierde ninguna función gen A Duplicación gen A Mutación gen A gen A gen A Acumulación de mutaciones Etc... gen A gen B

20. Elementos de inserción. IS IS A “salto” de un elemento de inserción gen A gen A gen A DESTRUIDO B “salto” de un elemento de inserción que lleva gen de interés genB genB GANANCIA DE FUNCIÓN Px C “salto” de un elemento de inserción que lleva secuencia promotora gen A EXPRESADO CONSTITUTIVAMENTE

21. gen N B A M C H I K Q J F G E T L Z Y X x y l R S • Transferencia genética • Paso de ADN de una bacteria a otra • Muy útil en ingeniería de rutas • Vehículos: • Plásmidos (TOL, NAH, SAL) unidad de replicación independiente • Transposones • Fagos • Existe transferencia génica en la naturaleza • - entre poblaciones naturales • - entre organismos introducidos y organismos indígenas • - ¿Retrotransferencia?

22. Aislamiento Reparación Diversidad genética Selección natural Condiciones de vida Entorno fisico-químico Entorno biológico Tamaño de la biosfera (ca. 1030 células) Elementos que intervienen en la evolución molecular de procariotas Limitaciones a la diversidad Fuente de diversidad Estrategias de variación Fuentes de mutación Errores Polimerasa Cambios locales de secuencia Agentes mutagénicos Reorganizaciones Recombinación “Reshuffling” Adquisición de ADN Transferencia horizontal

23. INTERCAMBIO DE GENES EN LA NATURALEZA A.- En microcosmos, entre organismos conocidos B.- Entre organismos indígenas y organismos introducidos C.- Entre poblaciones naturales, in situ

24. Añadir 4EB (4 mM) 108 Indígena Indígena 108 UWC1 UWC1 EB62 EB62 Log cfu/ml 104 Log cfu/ml 104 UWC1/EB62 UWC1/EB62 0 0 0 6 12 0 6 12 Tiempo (días) Tiempo (días) Transferencia de genes entre Pseusomonas en microcosmos Lodos industriales Pseusomonas EB62Plásmido TOL modificado. Crece en 4-Etilbenzoato. Pseusomonas UWC1RifR Inocular lodos con las dos cepas Medir supervivencia de las poblaciones Aparición de transconjugantes

25. Cl Cl n n Bifenilo Aroclor1242 P. aeruginosa JB2 + Muestra de suelo COOH Cl n Tomar muestras Sembrar en medios selectivos Transferencia de genes en el suelo: Obtención de organismos “recombinantes” in situ. Buscamos degradadores de Bifenilos policlorinados (PCBs) Es normal encontrar en la naturaleza degradadores de bifenilo. NO es normal encontrar degradadores de clorobenzoato en la naturaleza. TenemosPseudomonas aeruginosa JB2, capaz de degradar clorobenzoato. Queremos ver si esta cepa le puede transferir sus genes a alguna cepa del suelo, o vice versa.

26. Estrategia Cepa indígena Cl Cl n n PCBs bph Ciclo de Krebs P. aeruginosa JB2 COOH 9 8 OH Log CFU/g de suelo 5 Cl clc n OH 7 Cl Ciclo de Krebs n 6 5 0 25 50 Esto se ha conseguido en el laboratorio Tiempo (días) • ¿Ocurre en la naturaleza? • ”INOCULAR” CON EL GEN QUE FALTA • Tomar muestras y conteo de dos poblaciones: • Degradadores de bifenilo • Degradadores de clorobenzoatoPicar a bifenilo • Después de 15 días, empiezan a aparecer cepas capaces de degradar los dos compuestos. • 8 son P. aeruginosa JB2 (BIOLOG) • Se analizar algunos recombinantes: son INESTABLES • 1 es diferente  JB2-M (<78%) • La cepa indígena: Pseudomonas sp. AW

27. C.- Entre poblaciones naturales, in situ • Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.) • Análisis de la población: • Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno • Se analiza la población con respecto al gen nahAc • Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S

28. transparencia

29. C.- Entre poblaciones naturales, in situ • Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.) • Análisis de la población: • Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno • Se analiza la población con respecto al gen nahAc • Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S • Se observa que hay mucha más distancia evolutiva al analizar secuencias 16S que al analizar el gen nahAc •  Se deduce TRANFERENCIA HORIZONTAL (reciente). •  Datos sugieren que la transferencia de genes también ha ocurrido a grandes distancias (dispersión). •  Todas las cepas aisladas llevan un megaplásmido. nahAc se encuentra tanto en plásmido como en cromosoma, o en ambos.

30. ¿Puede mejorar el laboratorio a la naturaleza?