Základy sérológie - prednáška 11

1. Základy sérológie - prednáška 11 • Antigény - • Protilátky - typy, štruktúra, špecificita,úloha • Dynamika tvorby protilátok • Sérológické testy

2. Antigén • Látka vyvolávajúca odpoveď imunitného systému - imunitnú reakciu - špecificky proti nej a reagujúca s produktami takejto reakcie. • Imunogén - látka vyvolávajúca imunitnú reakciu • Haptén - látka schopná reagovať s produktami imunitnej reakcie. Samotný nevyvoláva imunitnú odpoveď, len po väzbe s nosičskou molekulou. Takýto konjugát má determinanty hapténu aj nosiča, typ nosiča ovplyvňuje vlastnosti konjugátu ako celku

3. Imunogenicita • Cudzorodosť - imunitný systém odlišuje medzi vlastným a cudzím tak, že len cudzorodé molekuly sú imunogénne • Veľkosť - priamo úmerne - molekula musí mať hmotnosť minimálne 5 kD, aby bola imunogénna. Menšie molekuly len v prítomnosti adjuvns • Chemické zloženie - čím komplexnejšia molekula tým imunogénnejšia. Proteiny, polysacharidy, nukleové kyseliny, lipidy • Fyzikálne vlastnosti - korpuskulárne antigény : solubilné antigény • Schopnosť byť degradované - ľahko fagocytované sú imnogénnejšie (fagocytóza, spracovanie, degradovanie, prezentovanie T bunkám prostredníctvom APC)

4. Schopnosť imunitne reagovať • Genetické faktory - druhovo závislá schopnosť, individuálne ovplyvnená - responders, non-responders. Neprítomnosť alebo alterácia génov kódujúcich receptory na T alebo B bb, podmieňujúcich prezentáciu antigénu prostredníctvom APC • Vek - deti do 3. roku - polysacharidové antigény. Starí - zlá odpoveď na antigény, hypoproteinémia Spôsob podania • Dávka - hraničná dávka, • Cesta - s.c., i.v., i.g., • Adjuvans - zvyšujú imunitnú odpoveď slabých imunogénov

5. Typy antigénov • T independentný Ag - na T bunkách nezávislý - priamo stimuluje B lymfocyty k premene na plazmatické bb a tvorbe protilátok. Sú to obvykle polysacharidy s polymérnou štruktúrou - opakujúce sa antigénne determinanty reagujú s veľkým počtom molekúl imunoglobulínov, reakcia je stále rovnaká, tvorba IgM protilátok Niektoré (T1) sú schopné vyvolať polyklonálnu aktiváciu B lymfocytov. T2 - nie. Odolávajú degradácii. • T dependentné - niekoľko kópií viacerých antigénnych determinán. Vyvolajú tvorbu protilátok len prostredníctvom T lymfocytov. Proteinové antigény

6. Antigénne determinanty - epitopy • Imunitný systém nerozpoznáva inf. agens ako celok. Reaguje s oblasťami s výraznou antigénnou štruktúrou na povrchu cudzorodej látky - epitopmi. Tvar epitopu, jeho elektrónova konfigurácia, reaguje s paratopom - časťou protilátky alebo receptoru na T lymfocytoch.Viacstupňová ochrana. • Determinanty rozpoznávané B bb. - lineárne, sekvenčné - primárna štruktúra , alebo sekundárna, terciárna, kvartérna štruktúra - konformačné. Malé a limitovný počet • Determinanty rozpoznávané T bb. - primárna sekvencia aminokyselín. (Tbb nerzopoznávajú polysacharidové ag a NK). Epitopy nemusia byť na povrchu, rozpoznanie T lymfocytmi vyžaduje ich proteolytické spracovanie a prezentáciu prostredníctvom APC a MHC molekúl.

7. Superantigény • Bežné T dep. antigény aktivizujú len malú časť T bb. 10-100 000 - mono/oligoklonálna aktivácia • Superantigény - aktivizujú až 25% všetkých T lymfocytov - polyklonálna aktivácia - búrlivá reakcia • Stafylokokový enterotoxin, Stafylokokový toxín toxického šoku STST, Stafylokokový exfoliačný toxín SSS….

8. Špecificita antigénov • Prekrývajúce sa epitopy • Podobné epitopy • Štrukturálna špecificita - chemická odlišnosť • Distribučná špecificita - Epitop je súčasťou antigénu iného typu molekuly (glukózový zbytok je súčasťou molekuly X aj Y -tá istá protilátka bude reagovať len na inom mieste • Skrížená reaktivita - niektoré bakteriálne antigény a antigény na ery - heterofilné antigény

9. Protilátky • Imunoglobulíny - glykoproteinové molekuly produkované plazmatickými bb ako odpoveď na imunogén, ktoré plnia funkciu protilátky. • Behring a Kitaso - krvné sérum imunizovaných zvierat obsahuje látky špecificky neutralizujúce imunizujúcu látku - toxin. (antisérum) • Elektorforéza séra - globulínové frakcie obsahujúce protilátky -5 tried imunoglobulínov. Najviac vo frakcii gama.

10. Štruktúra protilátok • Základná štruktúra imunoglobulínovej jednotky • 2 identické ťažké a 2 identické ľahké reťazce disulfidické väzby - ťažké a ľahké navzájom a 2 ťažké spolu - inter-chain - intra-chain • Variabilné a konštantné oblasti - na základe variability aminokyselín sú ťažké aj ľahké reťazce rozdelené: VL CL VH CH • analýza sekvencií aminokyselín variabilných oblastí ľahkých aj ťažkých reťazcov ukázala existenicu hypervariabilných oblastí- HVR (alebo komplementaritu určujúcich oblastí CDR).Ab s rôznou špecificitou majú rôzne HVR oblasti - oblasť s rozmanitosťou am.k. ktoré predstavujú priamy kontakt s Ag • flexibilná kĺbová oblasť - • Domény - ťažké ani ľahké reťazce nie sú ploché, ale sú to priestorové oblasti - domény

11. Imunoglobulínové fragmenty rozloženie papainom v kĺbovej oblasti, • 2 Fab fragmenty - 2 identické fragmenty (ľahký reťazec a VH a CH1 ťažkého reťazca) - obsahujú antigén viažúce miesta - antigen binding - ab - protilátka viaže rôzne antigénne determinanty pretože má zvláštnu kombináciu VL a VH + • 1 Fc fragment (kryštalizujúci) - obsahuje 2 ťažké reťazce obsahujúce každýCH2 CH3. Efektorová funkcia imunoglobulínu • rozloženie pepsinom - rozpustenie inter chain väzieb a vznik F(ab´)2 - divalentný fragment, ktorý obsahuje obidve väzobné miesta, viaže Ag, ale nemá efektorovú funkciu

12. Triedy, podtriedy, typy a subtypy • Triedy - 5 - na základe odlišností v sekvencii aminokyselín v konštantnej oblasti ťažkých reťazcov (CH): IgG, IgM, IgA, IgD, IgE • Podtriedy - menšie rozdiely sekvencií aminokyselín v CH : IgG1,IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 • Typy - podľa typu ľahkých reťazcov - rozdiely v sekvencii aminokyselín v konštantnej časti ľahkých reťazcov - kappa ľahké reťazce, lambda ľahké reťazce • Subtypy - podľa rozdielu sekvencie aminokyselín v konštantnej oblasti lambda reťazcov na lambda 1,2,3,4, Heterogenita - imunoglobulíny sú populáciou veľmi heterogénnou oblasti ľahkých reťazcov, naviac sa odlišujú rôznymi vlastnosťami pre väzbu rôznych antigénov vo variabilných oblastiach ťažkých a ľahkých reťazcov(typy, subtypy, triedy podtriedy)

13. Izotyp, allotyp, idiotyp • Izotyp - antigénne determinanty, ktoré charakterizujú triedy a podtriedy - ťažkých reťazcov a typy a podtypy ľahkých reazcov.Každá trieda, podtrieda, typ a podtyp imunoglobulínov má vlastný súbor izotypových determinant. Sú viazané na Fc fragment a sú spoločné pre druh. • Allotyp - predstavujú malé rozdiely v sekvencii ťažkých a ľahkých reťazcov rôznych jedincov .Lokalizované na konštantnej oblasti ťažkých a ľahkých reťazcov. • Idiotyp - jedinečná antigénna determinanta prítomná na molekulách protilátky rovnakej špecificity v hypervariabilnej oblasti. Lokalizované v Fab fragmente

14. IgG • Monomér • podtriedy sa odlišujú počtom disulfidických väzieb v kĺbovej oblasti • tvorí 75% sérových Ig, najpočetnejší aj v extravaskulárnom priestore • Jediný prechádza placentárnou bariérou, na bunkách placenty sú reťazce pre Fc oblasť IgG (IgG2 neprechádza) • Viaže komplement (IgG4 nie) • Viaže sa na makrofágy, monocyty, PMNL, a niektoré lymfocyty - internalizácia antigénu. Opsonizácia antigénu • Polčas rozpadu - 21 dní

15. IgA • Sérový IgA - monomér • Sekrečný - dimér s J reťazcom a proteinom T, ktorý je produkovaný epiteliálnymi bunkami a je priložený k IgA při prechode do sekrétov. Chráni ped degradáciou enzýmami v sekrétoch a při transporte cez mukózu. • 2. najčastejší v sére, najčastejší v slzách, slinách, kolostre - lokálna imunita • neviaže komplement • viaže sa na PMNL a niektoré lymfocyty • polčas 6 dní

16. IgM • Pentamér (normálne) - 5 identických monomérov viazaných J reťazcom, aj jako monomér • Prvý sa vytvára v plode aj po stimulácii B buniek • Dobre viaže komplement. IgM sú veľmi účinné pri lýze mikroorganizmu. Dobre aglutinuje • Polčas 5 dní • Viaže sa na Fc fragment niektorých bb. • IgM na povrchu B bb je monomér, ale má naviac 20 aminokyselín, ktorého zakotvujú do membrány. Je tu receptorom pre antigén (T independentný). Po ich kontakte prechádza signál k aktivácii B bb na premenu na plazmatické bb. U T dependentného antigénu je potrebný ešte signál od T helper bb

17. IgD • Monomér • veľmi nízke hladiny v sére • úloha nejasná • nachádzajú sa na povrchu B bb s extra aminokyselinami na C konci- ako receptor pre antigén - • neviaže komplement • polčas 3 dni

18. IgE • Monomér s extra doménov v konštantnej oblasti • najmenej častý v sére • viaže veľmi pevne Fc receptor na basofiloch a mastocytoch aj pre väzbou s Ag • Po väzbe s Ag dochádza degranulácii vazoaktívnych látok z buniek - prejavy alergie • úloha při parzitárnych ochoreniach - Fc receptor pre IgE na eosinofiloch, IgE obaľujú parazity a táto väzba vedie k zabitiu parazitov • neviaže komplement • polčas 2 dni

19. Funkcia - špecificky viažu 1 alebo niekoľko veľmi podobných antigénov. Každý Ig viaže špecifickú antigénnu determinantu - epitop svojim paratopom. - efektorová funkcia - následok špecifickej väzby Ag+Ab - sprostredkovanie väzby komplementu, alebo väzby na rôzne typy buniek - PMNL, lymfocyty, trombocyty, bazofily, eozinofily…..

20. Rozpoznávanie antigénu • Imunitný systém vznikol k ochrane proti cudziemu - škodlivému. Nesmie rozpoznávať vlastné. Na tom sa podieľajú 2 systémy humorálny (protilátky) a celulárny (bunky). • Humorálny - protilátka je rozpoznávacia molekula humorálneho systému - cirkuluje v krvi a tekutinách alebo je prítomná na povrchu B lymfocytu. Po kontakte so špecif. antigénom transformuje b. lymfocyt na plazmatickú bunku, ktorá produkuje identické protilátky • Celulárny - receptor na povrchu T lymfocytu rozpoznáva len fragment antigenu, ktorý mu predložili APC bunky vo väzbe na MHC. MHC jeviazaný na povrch buniek, preto T lymfocyty rozpoznávajú ag len viazané s bunkami

21. Rozmanitosť protilátok - suma možných Ab špecificít, ktoré organizmus môže vytvoriť • Ag si vyselektuje zo všetkých protilátok len tie, ktoré sa viažu na jeho epitop = obrovské množstvo rôznych protilátok • Paratop imunoglobulínu je tvorený HVR oblasťami ľahkých a ťažkých reťazcov. Ktorýkoľvek ľahký sa môže spojiť s ktorýmkoľvek ťažkým. Teoreticky je možné vygenerovať 107 rôznych špecificít. • Genetická výbava pre tvorbu ťažkého reťazca ( oblasť V(200), D(12) a J(4 možností) = 200x12x4x9600 pre tvorbu ľahkého reťazca V(200) a J(5)=200x5=1000 1000x10 000=10000000=107

22. Klonálna selekcia • B aj T lymfocyty pri svojom vývoji v lymfatickom tkanive získajú určitú špecificitu paratopu, ktorý rozpozná len určitý epitop antigénu. Po skutočnej väzbe takéhoto epitopu na zodpovedajúci paratop dôjde k selektovanej proliferácii a dozrievaniu danej bunky a vzniku dcérskych bb s rovnakými genetickými determinantami

23. Syntéza protilátok • Tvorba protilátky po expozícii antigénu - lag fáza, logarytmická, plató, pokles • B lymfocyty sú stimulované k tvorbe IgM protilátok, po určitej době môže dôjsť k prepnutiu - změna na IgG protilátky, prípadne k stimulácii pamäťových buniek • Pri ďalšom stretnutí s tým istým antigénom je lag fáza kratšia, bunky sú v rôznej fazí aktivácie, protilátky sa detekujú skôr a vo vyššej koncentrácii. Produkujú sa aj IgM ale v nízkej koncentrácii - produkujú ich B lymfocyty, ktoré vznikli až po predošlej expozícii

24. Význam špecifických protilátok v diagnostike • Mikroorganizmus (cudzí antigén) vyvolá tvorbu špecifických protilátok: • IgM sú detekovateľné po 7-14 dňoch , MX v sére po 3 mesiacoch, vymiznú - podľa stimulácie po 3-6 mesiacoch - akútne • IgG sú detekovateľné po 14-21 dňoch a ich pokles je pomalý, niektoré pretrvávajú celoživotne - protektívne • Pri detekcii celkových protilátok - štvornásobný vzostup titra v odstupe 14-21 dní alebo serokonverzia z negativity na pozotivitu.

25. Reakcia antigénu s protilátkou • Ag s protilátkou vytvára imunokomplexy, čím sa obmedzuje šíreni antigénu, umožňuje sa fagocytóza, aktivizuje sa komplement, dochádza k lýze bakteriálnej bunky. Protilátky sú účinné len proti antigénom, ktoré nie sú internalizované

26. Sérologické reakcie • Reakcia • známy antigén + neznáma protilátka (v sére)- nastavenie reakcie podľa vlastností antigénu, protilátky a toho, čo chceme dokázať. Pomer antigénu a protilátky. Nadbytok Ag alebo Ab • Prostredie • Spôsob vizualizácie

27. Aglutinácia • Korpuskulárny antigén: protilátky proti nemu aglutinujú - zhlukujú - antigén IgM sú dobre aglutinujúce protilátky • Reakciu môžme postaviť na dôkaz antigénu alebo protilátky • Na zlepšenie vizualizácie môžme použiť nosič (latexové čiastočky, erytrocyt s naviazaným antigénom -pasívna hemaglutinácia) • Efekt prozoony • Priama, nepriama, kvalitatívna, kvatitatívna • Hemaglutinačne inhibičný test

28. Precipitácia • Komplex antigénu s protilátkou vytvorí precipitačnú líniu - test CRP v kapilárach, alebo v agare • radiálna imunodifúzia Mancini - antigén je inkorporovaný do agaru, sérum je nakvapkané do vytvorených jamiek. Ak je prítomná protilátka, difunduje do agaru a spojí sa s Ag - vytvorí precipitačnú líniu • Imunodifúzia podľa Outcherlonyho • Imunoelektorforéza

29. Neutralizácia • Vírus + sérum s protilátkami = inhibícia životných prejavov vírusu

30. KFR • Reakcia spotreby komplementu: • Reakcia antigénu s protilátkou spotrebuje komplement ak je protilátka prítomná • po pridaní hemolytického systému zvieracie erytrocyty + protilátka proti erytrocytom nezostal komplement na hemolýzy erytrocytov - reakcia je pozitívna • ak v prvej časti reakcii nie je protiláka, komplement sa nespotrebuje a zostane k dispozícii pre druhú časť reakcie - dôjde k hemolýze - reakcia je negatívna

31. ELISA • Na povrch polystyrénovej jamky je naviazaný antigén. Sérum, v ktorom hľadáme protilátky pridáme do jamky. Ak v sére je protilátka, naviaže sa na antigén, ktorý pevne lpie na povrchu jamky. Nenaviazanú protilátku odplaví při premývaní voda. • Pridáme ďalšiu protilátku (komerčnú označenú farbičkou, alebo enzýmom, ) proti hľadanej protilátke v sére. Ak je naviazan na platničku cez antigén, naviaže sa aj komerčná protilátky. • Túto potom môžme detekovať podľa zmeny farby.

32. Imunofluorescencia IFT • Na podložnom sklíčku máme antigén, pridáme sérum s hľadanou protilátkou, ktorá vytvorí pevný komplex. Pridáme ďalšiu protilátku - proti hľadanej protilátke - označenú fluoresceínom. Ak vznikol komplex antigén, protilátka, 2.protilátka s fluoresceinom - vo fluorescenčnom mikroskope sledujeme fluorescenciu.

33. Western blot • Na prúžku papiera je nanesená a elektroforézou rozložená antigénna štruktúra vírusu alebo baktérie. • Pridáme na prúžok sérum. Ak obsahovalo protilátky proti vírusu alebo baktérii naviažu sa zodpovedajúcom mieste prúžku. Po pridaní ďalšej protilátky proti komplexu ag-ab s farbičkou, sa zviditeľnia na prúžku. • Môžme oddiagnostikovať prítomnosť protilátok proti viacerým antigénom mikroorganizmu

34. Dynamika tvorby protilátok po podaní antigénu

35. Afinita a skrížená reaktivita protilátok

36. Imunodifúzia

37. Závislosť aglutinácie na ekvivalentnom pomere ag a ab

38. Princíp hemaglutinácie a fenoménu prozóny

39. Princíp ELISA testu

40. Princíp imunofluerescenčného vyšetrovania protilátok

41. Význam a limity serologických reakcií • Prítomnosť protiálok poskytuje obraz o anamnéze pacientových infekcií • identifikácia mikroorganizmu, jeho typu • stanovenie priebehu ochorenia, chronicity na základe protilátok proti jednotlivým antigénom, ktoré sú prítomné v rôznom období ochorenia. • Titer - obrátená hodnota riedenia séra, v ktorom došlo k reakcii • Falošná pozitivita, negativita, skrížené reakcie. • Liečime pacienta s ochorením a nie sérologické titre

42. HODNOTENIE SEROLOGICKÝCH REAKCIÍ Kvalitatívna reakcia: pozitívny alebo negatívny (porovnaním s hraničnou hodnotou) Kvantitatívna reakcia: titer protilátok alebo koncentrácia Určovanie protilátok celkových (KFR,aglutinácia .....) – dynamika tvorby protilátok – 2 vzorky v odstupe 14 dní – výsledok sa udáva ako riedenie séra a alebo ako titer protilátok Určovanie jednotlivých tried imunoglobulínov -IgM, IgA včasné, akútne ochorenie - IgG neskoré, protektívne, dlhodobé výsledok sa udáva v koncentráciu – g/l Dôkaz akútneho ochorenia štvornásobný vzostup alebo pokles titra protilátok, konverzia z negativity na pozitivitu dôkaz IgM protilátok