UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE

1. UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE Doc. dr Dejan Škorić

2. MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE • Matične ćelije hematopoeze (MĆH) formiraju zrele ćelije krvi i imune ćelije. • Pluripotentne MĆH (PMĆH) su nediferentovane ćelije koje imaju sposobnost samoobnavljanja, proliferacije, diferencijacije u pravcu raznih specijalizovanih ćelija krvi, usađivanja u odgovarajuću mikrosredinu i mobilizacije iz kostne srži (KS) u perifernu krv (PK). • PMĆH su veoma retke jer je samo 1 od 10.000 ili 15.000 ćelija sa jedrom u KS pluripotentna MĆH. U UK 1 od 1000 ćelija sa jedrom je MĆH.

3. MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE • Pluripotentne MĆH se diferentuju u pluripotentne progenitore (PP), koji su i dalje pluripotentni, ali sa redukovanim potencijalom samoobnavljanja. Daljom diferencijacijom iz njih nastaju pluripotentni mijeloidni progenitori (PMP) i pluripotentni limfoidni progenitori (PLP). Od PMP i PLP nastaju progenitori opredeljeni za dve ili samo jednu lozu. Ovi poslednji se nazivaju opredeljeni progenitori. • Pluripotentne MĆH i progenitorske ćelije nisu morfološki prepoznate i jedini morfološki parametar kojim su ove ćelije definisane je, da pripadaju mononuklearnoj ćelijskoj subpopulaciji i da su veličine malog limfocita. • Daljom diferencijacijom opredeljenih progenitora nastaju morfološki prepoznatljive ćelije, koje se nazivaju prekursorske ćelije i iz kojih sazrevanjem nastaju zrele krvne ćelije (Slika 1).

4. Slika 1. Šematski prikaz hematopoeze. Sa leve strane se nalaze uobičajene kombinacije antigena koje odgovaraju određenom stepenu diferencijacije, a sa desne strane su prikazani in vivo i in vitro testovi za identifikaciju MĆH, progenitorskih ćelija i zrelih ćelija krvi (preuzeto iz Lord i sar., Stem Cells, 1997).

5. Fenotipska identifikacija matičnih ćelija hematopoeze • Humane pluripotentne i opredeljene MĆH imaju na svojoj površini CD34 antigen. Ovaj antigen je prisutan na 1-4% mononuklearnih ćelija (MNĆ) kostne srži i 1-2% MNĆ umbilikalne krvi (UK); • CD34+ ćelije predstavljaju heterogenu populaciju i među njima se nalaze: pluripotentne MĆH (oko 1-5%KS; 10%-UK), progenitorske ćelije (oko 20%) i nematične ćelije;

6. IZVORI MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE • Kostna srž (Thomas i sar., 1957) • Periferna krv (Goldman i sar., 1979) 90% Autolognih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK • Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)

7. IZVORI MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE • Kostna srž (Thomas i sar., 1957) • Periferna krv (Goldman i sar., 1979) 90% Autologih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK • Umbilikalna krv (Gluckman i sar.,1989)

8. PODELA ALOGENIH TMĆH PREMA VRSTI DAVAOCA • singene–davalac je identičan blizanac • alogene od srodnog-podudarnog davaoca(30%) • alogene od nesrodnog-podudarnog davaoca (50-80% – KS ili PK) • alogene od nesrodnog-nepodudarnog davaoca (15-30% → UK)

9. UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat) • Gluckman i saradnici su 1988. godine izveli prvu transplantaciju MĆH iz UK u dečaka sa Fanconijevom anemijom. Davalac je bila njegova HLA-podudarna sestra(Gluckman i sar., 1989). • Početkom 90-ih, urađene su prve TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a 1992. i 1993. formirane su prve banke za UK (Njujork, Milano i Diseldorf) (Rubinstein i sar., 1993). • Krajem 90-ih godina urađeno je nekoliko stotina TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a započeto je i intenzivno korišćenje UK za transplantaciju u odraslih bolesnika (Laughlin i sar., 2001).

10. UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat) • U toku 2004. godine, ustanovljeni su kriterijumi za indikacije i izbor uzoraka UK za TMĆH (Gluckman i sar., 2004). • U današnje vreme ima preko 350.000 kriokonzervisanih uzoraka UK, dostupnih za alogenu TMĆH. Pretraživanje uzoraka UK se vrši preko Netcord organizacije (Wang i sar., 2009). • Do sada je ukupno urađeno preko 10000 TMĆH iz UK i oko 20% alogenih TMĆH poslednjih godina urađeno iz UK (Gluckman i sar., 2010).

11. Prednosti UK kao izvora MĆH (1) • Umbilikalna krv je neograničeno dostupan izvor MĆH.Formiranjem banaka za UK, potencijalno neograničen broj uzoraka UK može da se dugotrajno skladišti u njima; • Nema rizika za davaoce umbilikalne krvi. Ako se primenjuju uobičajene ginekološke procedure, prikupljanje UK je potpuno bezbedno po porodilju i novorođenče; • Umbilikalna krv je lako i brzo dostupan izvor MĆH. Zamrznuti uzorci u bankama za UK su godinama apsolutno dostupni za TMĆH, dok se godišnje se gubi iz registra (BMDW) oko milion dobrovoljnih davalaca KS ili PK i to zbog bolesti, gubitka volje za donaciju ili smrti.

12. Prednosti UK kao izvora MĆH (2) • Redukovana incidenca i težina GVHD posle TMĆH iz UK i pored HLA-nepodudarnosti je posledica smanjenog broja i imunske nezrelosti T limfocita i APĆ. T limfociti su “devičanski” i (10-1000 puta) manje aloreaktivni od ćelija iz PK. Smanjena je produkcija Th1 citokina (IL-2 i INF-γ), što doprinosi smanjenom kapacitetu T limfocita iz UK za Th1 citotoksični imunski odgovor. • Smanjen rizik od transmisivnih virusnih infekcija. Novorođenčad se inficiraju CMV i EBV u toku intrauterinog perioda (transplacentarno) ili perinatalno i infekcije su u tom uzrastu retke (1%). Inficiranost CMV i EBV je velika (do 70%) kod starije dece i odraslih osoba.

13. Nedostaci UK kao izvora MĆH (1) • Uzorci UK imaju manji broj MĆH u odnosu na kalem iz KS ili PK.Kalem iz KS ima 10 puta više CD34+ ćelija od prosečnog uzorka UK, a kalem iz PK i do 100 puta više. Posledice su: povećano je odbacivanje kalema (od 7% do 22%); produženo je vreme potrebno za obnavljanje granulocitopoeze (N>500/mm3) (od 23 do 33 dana), i trombocitopoeze (Tr>20.000/mm3) (od 54 do 90 dana) ipovećana je smrtnosti od posledica transplantacije (transplant related mortality - TRM) (od 20% do 44%) u odnosu na TMĆH iz KS od nesrodnih, podudarnih davalaca. Ćelijska doza je najznačajniji faktor za prognozuTMĆH iz UK.

14. Minimalna ćelijska doza za TMĆH iz UK • Deca: > 3,7 x 107 NĆ/kg • Odrasli: >2,0 x 107 NĆ/kg > 1,7 x 105 CD34+/kg > 4 x 104 CFU-GM/kg (Gluckman i sar., 2005)

15. Nedostaci UK kao izvora MĆH (2) • Uzorci umbilikalne krvi imaju manji broj i redukovanu funkcionalnu aktivnost limfocita i antigen prezentujućih ćelija u odnosu na kostnu srž ili perifernu krv.Funkcionalna nezrelost T limfocita povećeva rizik za nastanak teških infekcija u ranom posttransplantacionom periodu.Incidenca potencijalno fatalnih infekcija je značajno viša (sespa=55%) posle TMĆH od nesrodnih davalaca UK. • Umbilikalna krv se može samo jednom prikupljati – nema mogućnosti da se matične ćelije hematopoeze ililimfociti ponovo prikupljaju od istog davaoca. U slučaju recidiva maligne bolesti posle TMĆH iz KS ili PK, moguće je ponovo prikupiti MĆH ili limfocite od istog davaoca i primeniti sekundarnu TMĆH (retransplantacija), ili indukovati antitumorski efekat putem infuzije limfocita davaoca. UK se prikuplja samo jednom – neposredno posle rođenja deteta.

16. Primena UK u alogenoj TMĆH od nesrodnih davalaca • Ključno pitanje: kakvi su rezultati postignuti u lečenju dece i odraslih primenom UK u odnosu na KS i PK • Hwang i sar., 2007. godine su objavili izuzetnu retrospektivnu studiju u kojoj su zaključili: • Od 1124 objavljenih radova samo 6 mogu da se koriste u komparativnoj analizi WCE i PltE, TRM, aGVHD i cGVHD, RR, DFS i OS, posle primene UK (0-2 HLA-nepodudarnost) vs. KS (6/6 HLA-podudarnost); • Produženo je vreme prihvatanja kalema (WCE i PltE) i povećana je smrtnost od posledica transplantacije, ali je smanjen procenat relapsa i redukovana je incidenca i težina aGVHD i cGVHD, posle primene UK u odnosu na KS, tako da nema statistički značajne razlike u DFS i OS (i za decu i za odrasle).

17. Strategije za uvećanje ćelijske doze iz UK • Poboljšanje metodologije prikupljanja i kriokonzervacije uzoraka UK; • Simultana transplantacija 2 uzorka UK – dvostruka TMĆH iz UK; • Ex vivo ekspanzija MĆH iz UK; • Primena kondicionog protokola sa redukovanim dozama radio i/ili hemioterapije.

18. Prikupljanje uzoraka UK – određivanje hematološkog potencijala • Adekvatno prikupljanje UK je neophodno za obezbeđivanje kvalitetnih uzoraka UK, što podrazumeva uzorke sa što većim hematološkim potencijalom. • Hematološki potencijal predstavlja sposobnost određenog kalema da obnovi hematopoezu i posredno se određuje na osnovu broja NĆ, CD34+ ćelija i opredeljenih progenitorskih ćelija (CFU-GEMM, CFU-GM i BFU-E). • Harris i saradnici (1994) su u fundamentalnoj studiji prikazali da, bez obzira na metod prikupljanja UK, broj NĆ u jednom ml UK je uvek isti. To praktično znači da se prikupljanjem uzorka sa većom zapreminom, obezbeđuje veći apsolutni broj NĆ.

19. Prikupljanje uzoraka UK • Optimalan i opšteprihvatljiv metod prikupljanja UK još uvek nije ustanovljen. • Dileme i pitanja u vezi procedure: ko (ginekološko osoblje ili specijalizovani timovi), kada (pre porođaja placente ili posle porođaja placente; rano klemovanje pupčanika ili odloženo), kako (putem gravitacije ili nekim drugim metodom) treba da prikuplja UK da bi dobio kvalitetne uzorke sa najvećom mogućom zapreminom i bez kontaminacije sa patogenim agensima i limfocitima porodilje. • Do sada je postignuta jedino saglasnost u vezi sa korišćenjem zatvorenih sistema (setova) za prikupljanje i delimična saglasnost o ranom klemovanju pupčanika posle porođaja deteta.

20. Prikupljanje uzoraka UK – metodi • In utero metod • Ex utero metod • Kombinovanimetod

21. In utero metod Prikupljanje UK in utero metodom se obavlja u toku trećeg stadijuma porođaja, tj. neposredno po rođenju deteta, a pre porođaja posteljice. Kese su postavljene ispod nivoa posteljice, što omogućava oticanje krvi iz posteljice i pupčanika u kese pod dejstvom gravitacije. Proceduru vrše ginekolozi ili babice. Prednosti in utero metoda: • izbegavanje procesa koagulacije UK i stvaranja ugrušaka; • Izbegavanje moguće rupture posteljice i pupčanika u toku porođaja. Nedostaci in utreo metoda: • veća mogućnost bakterijske kontaminacije uzoraka UK; • proceduru obavlja ginekološko osoblje, čija je pažnja više usmerena na porođaj. Većina autora je prikazala da je in utero metod efikasniji od ex utero metoda.

22. Prikupljanje uzoraka UK-uticaj ginekoloških faktora • Na zapreminu uzorka UK pored metoda prikupljanja utiču i ginekološki faktori (Jones i sar., 2003; Askari i sar., 2005; Solves i sar., 2005; Mancinelli i sar., 2006; George i sar., 2006). • U svim studijama je potvrđeno da telesna težina novorođenčeta (TT) i težina placente (TP) utiču na zapreminu i broj ćelija, tj. veća TT i TP obezbeđuju uzorke sa većom zapreminom i brojem ćelija. • Otkriveno je da na zapreminu uzoraka utiče i dužina pupčanika (duži pupčanik/↑v), broj prethodnih trudnoća (prvorođeno dete/↑v), gestacijski uzrast (duže trajanje trudnoće/↑v), način porođaja (Carski rez/↑v) i pol deteta.

23. Kriokonzervacija uzoraka UK(1) • TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, zahteva efikasne procedure prikupljanja, obrade i kriokonzervacije (Wall i sar., 2005). • Namena različitih metoda (protokola) kriokonzervacije je sprečavanje mogućih oštećenja ćelija tokom procesa zamrzavanja i odmrzavanja (tzv. kriooštećenja). • Da bi se sprečio nastanak kriooštećenja, neophodno je odrediti optimalnu brzinu hlađenja i koncentraciju krioprotektora, jer su to dva glavna faktora koji utiču na preživljavanje zamrznutih ćelija (Balint i sar., 1999). • Brzina hlađenja može biti kompjuterski kontrolisana (programirano zamrzavanje) ili nekontrolisana (neprogramirano zamrzavanje), a od krioprotektora se u današnje vreme koriste jedino dimetilsulfoksid (DMSO) i HES (Hunt i sar., 2006).

24. Kriokonzervacija uzoraka UK(2) • Protokoli kriokonzervacije UK su nastali od protokola korišćenih za zamrzavanje matičnih ćelija KS i PK; • Prilikom kriokonzervacije kalema iz KS ili PK nije neophodno da oporavak ćelija bude optimalan, jer obično u kalemu pre kriokonzervacije ima „višak“ MĆH. • Suprotno od KS i PK, u UK se nalazi inicijalno mali broj MĆH, tako da je neophodno da kriokonzervacija bude optimalna, tj. da što je moguće veći broj ćelija preživi zamrzavanje.

25. Kriokonzervacija uzoraka UK(3) • Donaldson i saradnici (1996) su prvi objavili komparativnu studiju u kojoj su vršili kriokonzervaciju uzoraka UK sa različitim koncentracijama DMSO-a, u kombinaciji sa različitim brzinama hlađenja. • Zaključili su da je kompjuterski kontrolisana brzina hlađenja od 1 do 2 ºC/min, kao i koncentracija DMSO-a od 5% do 10%, odgovarajuća za adekvatan oporavak CD34+ ćelija. • Kasnije, u drugim studijama su prikazani oprečni rezultati oporavka MĆH posle primene programiranog ili neprogramiranog zamrzavanja (Ballatore i sar.,1996; Shlebak i sar., 1999;Hunt i sar., 2003;Meyer i sar., 2006).

26. Naša iskustva • Prvi uzorak UK u Srbiji je prikupljen u junu 2000. godine (Škorić, Sinđić, Popović) • Kasnije je prikupljeno preko 100 uzoraka upotrebom aktivnog i standardnog in utero metoda

27. Škorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M., Stojimirović E., Rodić P., Jovanović N.: Savremene mogućnosti korišćenja umbilikalne krvi kao izvora za transplantaciju matične ćelije hematopoeze. Bilt transf 2004, 50(1-2):123-126. Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Cryopreservation of umbilical cord blood. Bilt transfuziol 2006, 52 (1): 12-16. Škorić D. Umbilikalna krv kao izvor matičnih ćelija hematopoeze. Bilt.hetmatol. 2007, 35:27-34. Škorić D., Balint B., Petakov M., Sinđić M., Rodić P.: Collection strategies and cryopreservation of umbilical cord blood. Transfus Med. 2007 Apr;17(2): 107-13 Škorić D., Sindjić M., Balint B., Petakov M., Rodić P. Comparisson between two different umbilical cord blood collection strategies while the placenta is still in uterus. Pediatric Blood & Cancer 2006; 47(4):462 Škorić D., Sinđić M., Balint B., Petakov M. and Ivanovski P. Influence of Obstetric Factors on Quality of Umbilical Cord Blood Units. Pediatric Blood & Cancer 2008; 51(4):541 .

28. DOPRINOS METODOLOGIJI PRIKUPLJANJA, IZDVAJANJA I KRIOKONZERVACIJE MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE IZ UMBILIKALNE KRVI dr Dejan Škorić Doktorska disertacija, jun 2007.

30. Tabela 1. Rezultati prikupljanja UK upotrebom aktivnog i standardnog in utero metoda *Srednja vrednost ± standardna devijacija **Odbačeni uzorci su manji od 50 ml i/ili imaju manji apsolutni broj NĆ od 8 x 108 NSZ = nema statističke značajnosti

31. Tabela 2. Protokoli kriokonzervacije mononuklearnih ćelija umblikalne krvi

32. Grafikon 1.Procedura programiranog zamrzavanja se sastoji od 5 faza: I = 5°C/min, 4 minuta ; II = 0°C/min, 5 minuta (ekvilibracija); III = 2°C/min, 5 minuta; IV = 1°C/min, 35 minuta; V = 5°C/min, 5 minuta.

34. Tabela 2. Uticaj ginekoških faktora na kvalitet uzoraka umbilikalne krvi (TT i TP) *srednja vrednost ± standardna devijacija (SD)

35. Rezultati postignuti u našem istraživanju stvorili su tehničko-manipulativne preduslove za prikupljanje, izdvajanje i kriokonzervaciju umbilikalne krvi. Ovi preduslovi su neophodni za formiranje javne/nacionalne banke za UK u Srbiji, koja bi omogućila savremeno lečenje bolesnika u kojih je neophodna transplantacija matičnih ćelija hematopoeze od nesrodnih davalaca.