Gene Expression

1. Gene Expression נופר יורן אביטל קליין מנחה: פרופ' ניר פרידמן

2. האתגר הראשי: להבין את רמת הביטוי של גנים שונים במצבים וזמנים שונים.

3. כיצד נבחר את הכלי המחקרי מה אנחנו מחפשים? כמה צריך? איך נזהה mRNA? אז מה עושים?

4. Microarray - המרכיבים: • מערך מסיליקון או זכוכית המכיל קטעי DNA – oligonucleotides. • מאגר RNA – פרופיל מייצג של גנים המבוטאים בתאים מדגימות שונות. • סמנים פלורסנטיים (cy3cy5).

5. microarray

6. תת אתגר האתגר העולה משימוש בmicroarray הוא קבלת כמות גדולה מאוד של מידע, המקשה על היכולת שלנו להסיק מסקנות.

7. מmicroarray לייצוג בעזרת דנדוגרמה Upregulateddownregulated מmicroarray לייצוג בעזרת דנדוגרמה: o o o o o מצב ייחוס o o o o o

8. אחרי הרעיון המרכזי clustering - לפני זיהוי תבניות ביטוי ויצירת קבוצות גנים על פי רמות הביטוי. • למה? • גנים המסווגים לאותה קבוצה ככל הנראה חולקים: • תפקידים • מוטיבים בפרומוטור • ופקטורי שעתוק • משותפים. • "כל אחד הוא אור קטן וכולנו אור איתן"

9. מרחב הביטוי וקטור ביטוי למשל- במימד 3, (x,y,z) ניתן להציג גרפית. ניסוי 1 (log2) ניסוי 2 (log2) ניסוי 3 (log2)

10. clustering לאהיררכי היררכי Divisive (חלוקה) (צבירה) agglomerative unsupervised supervised

11. היררכי התוצאה- קבוצות מקוננות (מזכיר מיון פילוגנטי). שיטת צבירה, unsupervised איך מחליטים אם קבוצות דומות? Average linkage Complete linkage Single linkage

12. average linkage complete linkage single linkage

13. K-means clustering • "כל עוד הנר דולק אפשר לתקן" • מידע מוקדם על מספר הצברים הסופי. • זו שיטה לא היררכית, unsupervised. • K קבוצות דומות מבפנים אך שונות מבחוץ. AVG AVG AVG

14. מסקנות: • דרוש ידע ביולוגי קודם לקבלת החלטות (לעבודה!) • אין דרך אחת נכונה. • שיטות שונות מתאימות למטרות שונות. • שילוב שיטות עשוי להועיל.

15. משימוש בmicroarray ניתן לקבל מבט על ביטוי גנים : • בזמנים שונים 2. במצבים שונים

16. תבניות ביטוי גנים בתגובה לשינוי סביבה בתאי שמר • תאור התופעה: שמרים מסוג Saccharomyces cerevisiae השורדים במגוון שינויים סביבתיים.

17. מטרת הניסוי: לבדוק מה הם השינויים ברמת ביטוי הגנים בתגובה לשינויים סביבתיים ולהבין מה המכניזם המאפשר את ההסתגלות לשינוי ומההן ההשפעות הפיזיולוגיות של השינוי.

18. למה microarray? • השוואת מצבים. • רשת שלמה של בקרים (כולל סיגנלים שמבקרים אותם והמטרות אותן הם מבקרים). • תמונה רחבה יותר של התהליך

19. מהלך הניסוי תנאים סטנדרטים • שמרים שגודלו בתנאים סטנדרטיים • חשיפה לשינויים סביבתיים שונים. • חשיפה לעוצמות שונות של השינויים. • מעקב בזמנים שונים. • שימוש ב-142 מערכים. • המערכים מכילים כ6200 גנים מוכרים . • ביצוע clustering ומציאת תבניות. חומציות טמפ' מחסור בחומצות אמינו מזון

20. מה אפשר ללמוד מהכתמים? איזה קבוצה עוברת רגולציה ביחד תפקיד באותו תהליך מה רצף התהליכים שקרו המצב הפיזיולוגי של התא

21. ESR ESR – תוכנית ביטוי משותפת בתגובה למגוון שינויים סביבתיים . ESR ~900 Repressed ~600 Induced ~300 תהליכים הקשורים לגדילה מקודדים לחלבונים ריבוזומלים

22. Induced ESR מטבוליזם של פחמימות חמצון חיזור קיפול חלבונים דגרדציית חלבונים תיקון נזקי דנ"א סיגנאלים תוך תאיים

23. פרדוקס – א. איזוזימים מבוטאים בצורה שונה ב. גנים מנוגדים הוגברו יחד. (דוגמה: סינתזת ופירוק פחמימות תשמורת). הסבר אפשרי: הבדלים דקים בין האיזוזימים (ספציפיות הסובסטראט, מיקום בתא) הסבר אפשרי: התא מכין מאגר תעתיקים זמין משני התפקידים.

24. 25 ⁰ 37 ⁰ 29 ⁰ 33⁰ מה עוצמת הביטוי? כמה זמן הביטוי נמשך?

25. 25 ⁰ 37 ⁰ 37 ⁰ 25 ⁰ מסקנות: לא כתגובה לכל שינוי סביבתי מאפייני ESR נצפים ביצירת מצב עקה ולא בהפחתתו

26. הבקרה על ESR מסקנה: מערכותבקרהספציפיות לכל מצב ולכל גן האם זו מערכת רגולטורית אחת לכל המטרות או הרבה מערכות?

27. ESR מסקנות תגובה כללית למגוון עקות - מכונהESR גנים מוגברים וגנים מושתקים. הדלקת ה ESR היא מהירה וחולפת. התאמה בין עצמת שינוי התנאים לבין עצמת ומשך התגובה. בקרה לא אחידה. מערכות שונות המתאימות למצבים השונים.

28. בקרת ביטוי גנים במחזור התא בתאי שמרבדגש על Hcm1 • מטרת הניסוי: הבנת הבקרה ברמת השעתוק של גנים במחזור התא.

29. למה נרצה לבדוק את רמות השעתוק? • רמות שעתוק מחזוריות בשלב מסוים עשויות להצביע על פעילות מחזורית של תוצרי השעתוק בשלב מאוחר יותר • הבנת התהליכים הספציפיים במחזור התא וזיהוי פקטורי שעתוק החשובים לבקרתו.

30. שלב 1 • שימוש בנתונים מmicroarray בשלבים שונים בשילוב עם נתונים שנאספו בעבר. • זיהוי מאות תעתיקים המופיעים באופן מחזורי במחזור התא. • חישוב זמן שיא ממוצע לכל גן.

31. 1000 התעתיקים המחזוריים ביותר

32. שלב 2 • חיפוש אחר רצף שמור בפרומוטורים של הגנים המשועתקים בשלב S. • TAAACAA – ב40 גנים מתוך ה1000. עריכת חיפוש ביתר הגנום. • גילוי Hcm1 המאקטב את שלב S.

33. WHI5 LacZ האם הרצף השמור הכרחי לבקרת השיעתוק בשלב S?

34. שלב 3 • חקירת הtargets של Hcm1(TF) • מחזוריים כתלות בנוכחות Hcm1 מעורב בתהליכים שונים בשלב S

35. שלב 4 • חקירת פקטור השיעתוק Hcm1 • מתפקד גם בשלב M

36. מה יתרחש בהעדר Hcm1?

37. מסקנות • TF ספציפי למחזור התא. • מבוטא בסוף G1 ותחילת S. • הגנים המאוקטבים על ידיו מראים ביטוי שיא בסוף S. • חיוני גם לשלבים נוספים.

38. אז מה ראינו? • הכרנו את הכי המחקרי microarray. • ראינו שיטות לעיבוד וניתוח המידע המתקבל. • ראינו שני ניסויים המבוססים על תוצאות שהתקבלו משימוש בmicroarray להשוואת מצבים ושלבים שונים. לסיכום: אנליזת רמות ביטוי על ידי microarray מאפשרת הסקת ידע מעשי מנתונים בסדר גודל גנומי רחב. לא מדובר במדע מדוייק – לכן חשוב לבצע החלטות זהירות.

39. המאמרים: 1. Quackenbush J (2001) Computational analysis of microarray data. Nature Reviews Genetics 2:418-27. 2. Gasch AP et al. (2000) Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11(12):4241-4257. 3. Parmila T et al. (2006) The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Gene & Development 20:2266-78.