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1. STRESS DA BASSA CONCENTRAZIONE DI SIERO INDUCE ATTIVAZIONE DI HUMAN ENDOGENOUS RETROVIRUS-K IN CELLULE DI MELANOMA UMANO Serafino A.1, Balestrieri E.2, Pierimarchi P.1, Matteucci C.1, Moroni G.1, Oricchio E.1, Sorrentino R.2,Mastino A.3, Garaci E.2, Rasi G.1 e Sinibaldi Vallebona P.2 1Instituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare, CNR, Roma; 2Dip. di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche – Università di Roma “Tor Vergata”; 3Dip. di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari, Università di Messina. Background I retrovirus endogeni umani (HERVs) possono costituire fino all’8% del genoma umano e verosimilmente hanno avuto origine dall’infezione di cellule germinali da parte di retrovirus esogeni, durante l’evoluzione dei primati. Recentemente è stato ipotizzato che l’espressione dei geni di HERV, possa essere attivata durante lo sviluppo del melanoma umano. In particolare, espressione di geni di HERV-K è stata ritrovata sia in linee cellulari che in colture primarie di melanoma ma non in melanociti normali. Ulteriori evidenze su un possibile ruolo dei retrovirus endogeni nella progressione del melanoma sono state fornite da studi condotti su modelli animali. Figura 1 Dopo 4 giorni di coltura in condizione di stress indotto dall’impiego di bassa concentrazione (1%) di siero bovino fetale (FCS) nel mezzo di coltura, si osserva la presenza di numerosi gruppi di cellule rotondeggianti che si staccano dal monostrato residuo (dettaglio mostrato nel riquadro). Queste cellule con crescita in sospensione (denominate TVM-A12sp), una volta coltivate separatamente dal monostrato residuo, proliferano rapidamente e possono essere mantenute in coltura permanentemente come cellule in sospensione. Figura 2 Abbiamo testato, mediante microscopia confocale, le cellule TVM-A12, coltivate in condizioni ottimali di siero (10%) o in basso siero (1%), e le subculture con crescita in sospensione TVM-A12sp, per l’espressione di antigeni di HERV, usando un anticorpo specifico per i residui 42-50 [QRPGNIDAPC], corrispondenti ad una sequenza nucleotidica all’interno del gene env. Tutti i campioni esaminati sono risultati positivi per tale antigene, ma, mentre nelle TVM-A12 coltivate in presenza di 10% FCS e nel monostrato residuo coltivato in 1% FCS la positività mostrava una distribuzione prevalentemente nucleare, simile a quella tipicamente esibita da alcuni antigeni virali della fase di latenza, nelle subculture in sospensione TVM-A12sp tale positività mostrava una distribuzione puntiforme nel citoplasma, compatibile con una possibile replicazione virale in corso in tale compartimento. n: nucleo Risultati In questo studio noi dimostriamo che, in condizione di stress indotto dall’impiego di bassa concentrazione di siero bovino fetale (FCS) nel mezzo di coltura, cellule di melanoma umano sono in grado di passare spontaneamente da un fenotipo di crescita in aderenza ad un fenotipo stabilmente modificato con crescita in sospensione (Figura 1), e tale transizione è strettamente associata all’espressione del provirus di HERV-K. Infatti, le cellule con fenotipo modificato, derivanti della selezione cellulare stress-indotta, mostrano sia positività per antigeni di HERV (Figura 2), come osservato in microscopia confocale, sia alti livelli di trascrizione dell’RNA di HERV-K (Figura 3), come evidenziato dall’analisi in RT-PCR. Inoltre, in tali cellule, l’analisi del contenuto di DNA, mediante citofluorimetria a flusso, ha registrato la presenza di una più alta percentuale di cellule ipoploidi rispetto alla linea parentale (Figura 4), condizione questa spesso associata ad una maggiore aggressività dei tumori. Il fenomeno sopra descritto è stato riprodotto sia in una linea cellulare allestita nel nostro laboratorio a partire da una lesione metastatica di melanoma (TVM-A12), sia in una linea commerciale (M14), indicando che tale fenomeno non è limitato ad una singola linea cellulare di melanoma. Figura 3 L’analisi dell’espressione dell’RNA mediante RT-PCR nelle TVM-A12, coltivate sia in condizioni ottimali di FCS (10%) che in condizioni di basso siero (1%), e nelle subculture TVM-A12sp con crescita in sospensione, ha mostrato che le modificazioni fenotipiche causate dalla selezione cellulare stress-indotta erano associate ad alti livelli di trascrizione dell’RNA di HERV-K, ed in particolare, nelle subculture TVM-A12sp esclusivamente del trascritto di tipo 2, che sembra possa essere associato alla forma replicativa di HERV-K Figura 4 Analisi in citometria a flusso del contenuto di DNA nelle cellule TVM-A12, coltivate sia in condizioni ottimali di FCS (10%) che in condizioni di basso siero (1%), e nelle subculture TVM-A12sp con crescita in sospensione; il picco giallo (freccia) nell’istogramma citofluorimetrico rappresenta una popolazione ipoploide rispetto a quella maggiormente rappresentata nelle TVM-A12 coltivate in 10% di FCS; è da notare che la popolazione ipoploide è già presente nelle TVM-A12 coltivate in basso siero, dove la maggior parte delle cellule sono ancora con crescita in adesione. Inoltre, le colture TVM-A12sp con fenotipo modificato mostrano una percentuale di cellule in fase S due volte più alta, e ciò indica che esse posseggono una aumentata capacità di proliferare rispetto alla linea parentale. Conclusioni I nostri dati suggeriscono che l’attivazione di geni di HERV può essere un evento riproducibile in cellule di melanoma che siano sottoposte a condizioni di stress e che tale evento può risultare associato alla progressione del tumore. Corresponding authors: Annalucia Serafino PhD – E-mail: annalucia.serafino@artov.inmm.cnr.it Prof. Paola Sinibaldi Vallebona – E-mail:sinibaldi-vallebona@med.uniroma2.it