Vyšetření parametrů buněčné imunity

1. Vyšetření parametrů buněčné imunity Stanovení povrchových znaků lymfocytů a dalších buněk- vyšetření subpopulací lymfocytů; vyšetření exprese molekul – např aktivační znak HLA DR na monocytech při monitorování pacientů v sepsi) Funkční testy lymfocytů B lymfocyty- sledování produkce specifických protilátek (např. proti tetanu) - měření koncentrace Ig v supernatantu stimulovaných B lymfocytů T lymfocyty – test blastické transformace (aktivace lymfocytů), schopnost T lymfocytů reagovat na polyklonální mitogeny (PHA) nebo na specifický Ag (tetanický toxoid…)

2. Cytotoxicita NK buněk a T lymfocytů- stanovení funkce systému granzym/perforin, jde o složitou metodu, která je prováděna na specializovaných pracovištích, musí být připraveny efektorové buňky (TC, NK) a cílové buňky ( virem infikované buňky, nádorové buňky nebo APC prezentující testovaný Ag). Ke stanovení se používá radioaktivně značený chrom. Fagocytóza – k testu se používají mikrosférické hydrofilní partikule, nebo jiné substráty (Sacharomyces cerevisiae, stafylokoky…). Poruchy fagocytosy mohou odrážet i poruchu opsonizace, přenosu signálu, aktivace nitrobuněčných struktur a funkce kontraktilních mechanismů. Chemotaxe - schopnost fagocytujících buněk doputovat do místa zánětu - test in vivo : Rebuckovo kožní okénko - test in vitro: test v agaróze s chemoatraktantem a další

3. Test oxidačního metabolismu - sleduje se schopnost fagocytů redukovat bezbarvé substráty na barevné; diagnostika poruch v NADPH-oxidázovém systému Stanovení cytokinů - nejčastěji se stanovují IL-6 (při podezření na sepsi, trauma, srdeční selhání), IL-8 (jako IL-6, časná diagnostika ARDS- acute respiratory distress syndrom), TNF (typický pro syndrom systémové zánětlivé odpovědi) - určení hladiny cytokinové mRNA pomocí RT-PCR - stanovení cytokinů metodou ELISA Test aktivace bazofilů - po aktivaci bazofilů alergenem se stanovuje:a) exprese aktivační molekuly CD 63 pomocí průtokové cytometrie (BAT) b) mediátory (histamin, sulfidopeptidové leukotrieny) uvolněné při degranulaci (CAST)

4. Vyšetření apoptózy - pomocí průtokové cytometrie či fluorescenčního mikroskopu (DNA se značí pomocí propidium jodidu) Typizace HLA= určení HLA antigenů na povrchu lymfocytů 1) Sérologická typizace - mikrolymfocytotoxický test - princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) - za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb. (sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)

5. 2) molekulárně genetické metody - pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů 2a) PCR-SSP = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními specifickými primery - pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou 2b) PCR-SSO = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy - hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé alely 2c) PCR- SBT = sequencing based typing; sekvenování - nejpřesnější metodika HLA typizace - získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel