Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+

1. Thèse présentée par Emilie Loreau Identification de gènes impliqués dans le développement des lymphomes cutanés primitifs CD30+ Laboratoire d’Histologie et Pathologie Moléculaire des Tumeurs EA 2406 - Université Victor Ségalen Bordeaux 2 Directeur de thèse : Jean Philippe Merlio

2. Lymphomes • Définition Prolifération maligne de lymphocytes B ou T Localisation principale dans les tissus lymphoïdes Monoclonalité • Lymphoproliférations CD30+ Lymphome cutané primitif (LCP) CD30+ Papulose lymphomatoïde (Ply) Lymphome systémique CD30+ Peau Ganglion Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

3. Antigène de surface CD30 CD30L Membrane plasmique CD30 TRAF NF-KB MAPK • Récepteur transmembranaire (120 kDa) • Fonction • Famille du TNF-R • Expressions - Lymphocytes T activés sanguins (15%) - Lymphoproliférations CD30+ Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

4. Lymphome cutané primitif CD30+ Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

5. Lymphome cutané primitif CD30+ Epiderme Epiderme Derme Derme Prolifération tumorale Hypoderme Peau Saine LCP CD30+ Patient Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

6. Papulose lymphomatoïde / LCP CD30+ papule>nodule généralisée nodule>tumeur loco-régionale Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

7. L. systémique CD30+ / LCP CD30+ Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

8. Gènes et cancers Colon sain Oncogène Activation du cycle cellulaire Inhibition de l’apoptose Mutation dominante Gène suppresseur de tumeur Inhibition du cycle cellulaire Activation de l’apoptose Mutation récessive  APC  K-Ras  DCC  p53 … Cancer Cancer + Métastases Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

9. Objectif Oncogenèse du LCP CD30+ ? • Aide au diagnostic • Cible thérapeutique • Voies de transduction Etude du transcriptome Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

10. Etude du transcriptome • Approches globales Puce à ADNc mRNA differential display SSH « Substractive Suppressive Hybridization » • Approches ciblées RT-PCR RT-PCR en temps réel Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

11. Stratégie  Banque soustraite  Macro-array  RQ-PCR ? Réalisation de banques par SSH Criblage des banques Validation des gènes candidats Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

12. Principe de la SSH But Mise en évidence de gènes spécifiques d’une population cellulaire  Comparaison de deux populations cellulaires différentes : tester et driver  Gènes spécifiques de la population cellulaire tester • Normalisation entre les ARNm fortement ou faiblement représentés • Suppression des gènes présents dans les deux populations Diatchenko et al, 1996 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

13. Etapes de la SSH AAAA Hybridations PCR Clonage tester  RT RsaI tester ou driver Ligation Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

14. SSH a b c d a b c d b a b c d + e H1a Tester 1 e H2 Driver Ex PCR1 PCR2 Tester 2R H1b a, c et d Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

15. Choix des échantillons Prélèvement de la tumeur cutanée Prise de sang Lymphocytes sanguins Lymphocytes tumoraux 28S 18S ARN totaux ARN totaux ARN dégradés Tester Driver Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

16. SSH Etapes critiques 1 2 Gel d’agarose 1,2 % w/v ADNc non digéré ADNc digéré 1 2 3 4 5 Digestion des ADNc par RsaI (tester et driver) Ligation des adaptateurs pour créer deux populations tester Gel d’agarose 2 % w/v Marqueur PM 100 pb Tester 1, lié Tester 1, lié ou non tester 2R, lié tester 2R, lié ou non Introduction Introduction Banque SSH Banque SSH Criblage banque Criblage banque Validation candidats Validation candidats Conclusion Conclusion

17. Validation d’une banque SSH SNSSNS M SoustraitNon Soustrait 18 23 28 3318 23 28 33 SNS 8 SSH réalisées 3 SSH validées 4 SSH criblées Efficacité de soustraction PCR1 PCR2 Clonage dans le pGEM T vector Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

18. Criblage des banques soustraites S NS Organisation des banques sur membranes G A T T C G C A Séquençage Hybridation des sondes radioactives Clonage But Diminuer le nombre de faux positifs PCR2 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

19. A partir des clones Sonde tumorale Sonde non tumorale  Organisation des clones en deux boites homologues : grille à 228 positions  Transfert des bactéries sur membrane de nylon  Fixation de l’ADN des bactéries sur les membranes  Hybridation des sondes radio-marquées Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

20. Par Dot Blot Tumeur Non tumeur  Organisation des clones dans des plaques de 96 puits  PCR à partir des clones en suspension (amorces M13)  Fixation des produits de PCR sur deux membranes de nylon par Dot Blot  Hybridation des sondes radio-marquées Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

21. Résultats du criblage 2230 spots 349 clones 118 gènes candidats Criblage Séquençage Bibliographie : 16 gènes Dot Blot : 15 gènes Humanine Bcl11B CIN85 PTTG1 THW SPARC p120 cat + Validation RQ-PCR Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

22. Résultats du criblage Kératine 6 Annexes cutanées Surexpression dans un environnement prolifératif ARN 18S Track de A Surexpression dans les cellules tumorales CMH II Fortement exprimé dans les lymphocytes T activés Importance du choix des échantillons Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

23. Validation des candidats But Vérifier par une autre technique les variations d’expressions • PCR en temps réel ou RQ-PCR  Normalisation par PO(gène de ménage)  Quantification relative(tumeur par rapport à non tumeur) • Augmenter le nombre d’échantillons testés Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

24. RT-PCR en temps réel Echantillons testés 2 g • 11 cas de LCP CD30+ 7 tumeurs initiales 3 récidives 1 ganglion • 2 cas de L. systémique CD30+ • 7 lymphocytes sanguins sains Transcription inverse Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

25. RT-PCR en temps réel Amplification par PCR • Amplification avec des amorces spécifiques du gène d’intérêt • Utilisation d’un intercalent fluorescent : le SYBR-Green • Mesure de la fluorescence en fin d’élongation • Intensité de fluorescence quantité de cible Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

26. Exemple de résultats 5 mM 4 mM 3 mM T- 5 mM 4 mM Courbe de fusion 3 mM T- Cinétique Ct [MgCl2] pour le gène PO Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

27. Choix d’un gène de ménage  Choix des amorces : GAPDH, G6PD, PO, -actine  Etude sur 14 échantillons dont 4 tumeurs LCP CD30+  Travail en duplicate et en Ct Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

28. Choix d’un gène de ménage Gène de ménage actine   Gène de ménage GAPDH Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

29. Analyse des résultats de RQ-PCR  RQ-PCR en duplicate sur chaque échantillon  Moyenne des Ct des duplicates (0,3)  Gamme de dilution [concentration arbitraire] x  Normalisation : [Gène d’intérêt] [PO] Gènes d’intérêts Gène de ménage PO Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

30. Résultats RQ-PCR relative Surexpressions  THW (11) p120 caténine (7)  SPARC (5) PTTG1 (9) Sousexpressions  Humanine (9) CIN85 (7) Bcl11B (7) 31 candidats étudiés sur 13 échantillons Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

31. Gènes Surexprimés - THW ! THW et kératine 6 : même profil d’expression THW fortement exprimé dans les cellules épidermiques Perte d’hétérozygotie fréquente en 6q Mélanome sans métastase : 10 à 20 % Mélanome avec métastases : 50 % Gène suppresseur de tumeur Hildebrandt et al, 2000 et 2001 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

32. Gènes Surexprimés - p120 caténine E-cadhérine MP  cat  cat p120 Noyau p120 X actine ? Kasio Surexpression : cancer gastrique Sousexpression : autres cancers Quels sont les gènes inhibés dans les lymphocytes T ? Anastasiadis et Reynolds, 2001 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

33. Gènes Surexprimés PTTG1 Tumeurs initiales SPARC Surexpression : Lymphoproliférations T (70 %) Ségrégation des chromatides (mitose) Tumeurs initiales (facteur 4) Récidives (facteur 8 à 15) Glycoprotéine MEC Surexpression : certains cancers Pey et Melmed, 1997. Saez et al, 2002 c-jun SPARC AP1 JUN-B surexprimé dans LCP CD30+ Briggs et al, 2002. Mao et al, 2003 Oncogènes Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

34. Gènes sousexprimés Gène suppresseur de tumeur CIN85 Protéine adaptatrice Prolifération/apoptose ? Bcl11B Protéine doigt de zinc nucléaire Cerveau, système immunitaire Lymphomes du thymus (souris) : Délétions homozygotes Bax Apoptose Humanine Take et al, 2000. Gout et al, 2000 CIN 85 Apoptose (neurones) PI3K Wakabayashi et al, 2003 Humanine Oncogène Peptide anti-apoptotique (24 aa) Séquence homologue à l’ARN 16S Hashimoto et al, 2001. Guo et al, 2003 Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

35. Conclusion Quatre gènes surexprimés dans les LCP CD30+ SPARC et PTTG1 : oncogènes p120 caténine THW : biais expérimental (choix des échantillons de départ) Trois gènes sousexprimés Bcl11B : gène suppresseur de tumeur CIN85 Humanine Fonction oncogénique ou phénotype Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

36. Perspectives Augmenter le nombre des échantillons analysés : Marqueurs ? ISH ou microdissection : localisation des ARNm Immunohistochimie : localisation et niveau d’expression protéique SSH et CGH ? Voies de signalisations impliquant les différents gènes  CIN85 : recherche des partenaires - immunoprécipitation (prolifération ou apoptose) JUN-B et SPARC p120 et Kasio Introduction Banque SSH Criblage banque Validation candidats Conclusion

37. Remerciements Ce travail a été réalisé sous la direction du Pr. Jean Philippe Merlio Financement : Programme de Recherche Clinique d’Aquitaine Pr. Jacques Emile Bonnet Pr. Gilles Favre Pr. Pierre Brousset Laboratoire du Pr. Merlio Dr. Nathalie Carrère Jackie Ferrer Dr. Edith Chevret Laboratoire du Pr. De Mascarel Mme Beau Labo Bio Mol Pr. Marie Beylot Barry Dr. Béatrice Vergier Dr. Marie Parrens Endocube

38. Et aussi ! Martina Prochazkova Jean Christophe Cometta Pierre Dubus Christine Bartoli Fanny Pelluard Cédric Barrière Nicolas Bitteau Michelle Turmo Armelle Bolzec Sylvain Caillol Dominique Bertheau Henri Gomez Christophe Barthe Lilian Marc Antoine Belaud Rotureau Alexis Groppi Peyo Jean Christophe Garoste Brigitte Tauzin Ma famille et mes amis pour leur soutien permanent