Méthodes d’étude de la localisation subcellulaire d’une protéine

1. Méthodes d’étude de la localisation subcellulaire d’une protéine Figure 1: Localisation par fluorescence de la tubuline et de l’ADN dans des cellules végétales de tabac. (d’après Inserm)

2. I Localisation subcellulaire d’une protéine par observation au microscope électronique à transmission 1) L’autoradiographie • Un atome radioactif se trouve incorporé dans une protéine de la cellule et sert de traceur (marquage au tritium le plus souvent). • La détection de la radioactivité incorporée se fait ensuite par l’application d’une émulsion photographique sur la coupe: le rayonnement émis par les atomes radioactifs impressionne l’émulsion qui est alors révélée comme un film photographique. • Les grains d’argent métallique sont localisés au dessus des structures ayant incorporé les atomes radioactifs.

3. Expérience de Jamieson et PaladeSuivi à la leucine tritiée, grains de zymogène radioactifs. 3 minutes: grains d’argent sur le RE 20 minutes: grains d’argent sur l’appareil de Golgi 90 minutes: grains d’argent sur les vésicules sécrétrices Figure 2: Suivi de l’exocytose des grains de zymogène. (d’après le Alberts)

4. 2) La cytoenzymologie Localisation d’une enzyme à l’échelle subcellulaire via la visualisation des produits de la réaction qu’elle catalyse. 3) L’immunocytochimie Localisation de l’anticorps spécifique d’une protéine donnée par couplage à une molécule opaque aux électrons: une bille d’or. (localisation par immunogold).

5. II Localisation subcellulaire d’une protéine via la fluorescence • L’immunofluorescence • Localisation de l’anticorps spécifique de la protéine, donc localisation de la protéine. • Obtention des anticorps spécifiques par injection de la protéine donnée à un lapins et récupération et purification des anticorps alors produits. • Couplage des anticorps à un fluorophore pour observation au microscope confocal(couplage à l’anticorps primaire ou à un anticorps secondaire).

6. Localisation des microtubules Les microtubules du cytosquelette sont mis en évidence grâce à un anticorps dirigé contre la tubuline.Le protocole d’immunofluorescence a comporté deux étapes : - reconnaissance de la tubuline par un anticorps anti-tubuline (anticorps 1)- repérage par un deuxième anticorps fluorescent dirigé contre l’anticorps 1 Figure 3: Observation au microscope confocal de microtubules (CNRS)

7. 2)Localisation via la GFP • Emission de fluorescence à partir d’un ADN recombinant: promoteur du gène suivi de la séquence codante du gène sans son codon stop directement suivi de la séquence codante du gène de méduse Aequorea victoria codant la GFP. • Transcription et traduction classique aboutissant à une protéine fonctionnelle à laquelle est fusionnée la GFP.

8. Figure 4: Cellule souche mésenchymateuse observée au microscope confocal Les microtubules sont associés à la GFP et les histones 2b sont associés à la RFP.

9. III Avantages et inconvénients • Autoradiographie: nécessité de fixer les cellules, pas de vision en dynamique. • Immunofluorescence indirecte: observation de la cellule en dynamique, et phénomène d’amplification du signal possible. Mais appréciation de la fluorescence subjective. • Par la GFP, localisation in vivo des protéine, patron d’expression du gène dans le temps et l’espace… Mais recombinaison pas toujours efficace.