Regulación de la transcripción en eucariontes.

1. Regulación de la transcripción en eucariontes.

2. El control génico en eucarióticos • En organismos multicelulares su propósito es la ejecución de decisiones evolutivas precisas • Los genes convenientes se expresan en células adecuadas durante el desarrollo y la diferenciación. • Es el medio principal para regular la expresión génica en eucariontes. • Los elementos de control se encuentran a varias kilobases del sito de inicio de transcripción.

3. El control génico en eucarióticos • Poseen tres tipos de RNA polimerasas. • Tiene subunidades grandes que tienen homología con b y b´y pequeñas que tiene homología con la a de la RNA pol de bacterias. • Presentan otras subunidades pequeñas. • La RNA pol I sintetiza pre-RNA ribosomal • La RNA pol II sintetiza mensajeros, RNA pequeños nucleares • La RNA pol III sintetiza RNAr 5S, tRNA y RNAs estables y cortos.

4. RNA polimerasas

5. Subunidad L´ de Pol II • Contiene un extremo carboxilo terminal que es una repetición de la secuencia Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser • Conocido como el dominio carboxi-terminal o CTD. • Levaduras contiene 26 repeticiones o más, mamíferos 52 repeticiones otros eucariontes intermedia.

6. CTD • Se fosforila durante la iniciación de la transcripción • Permanece fosforilada durante la transcripción.

7. Foto fosforilación de CTD • Polimerasa no fosforilada verde • Polimerasa fosforilada roja

10. Núcleos aislados se incuban con 32P-NTP (periodo corto). • Se marcan entre 300-500 nucleótidos del RNA naciente. • Hibridizando el RNA marcado con el DNA clonado para un gen específico, se puede saber cual es la fracción de transcripción de un gen.

13. Identificación de RNA polimerasas de eucariontes • Cromatografía en DEAE sefadex.

14. Inicio de transcripción. • La RNA pol II suele iniciar la transcripción en un par de bases específicos o alternativos cercanos a una plantilla. • El nucleótido 5´que tienen el capuchón en un mRNA es el nucleótido en dónde inición la transcripción.

15. Iniciador en vez de caja TATA • Algunos genes no presentan caja TATA. • Presentan una secuencia relativamente degenerada con A en +1, Y es una pirimidina, N es cualquier base. 5’Y-Y-A+1-NT/A-Y-Y-Y(3’)

16. Hay genes que no presentan ni caja TATA ni Iniciador • Se presenta en genes de mantenimiento (housekeeping). • Es una región de 20 a 200 pares de base • Da origen a mensajeros con extremos 5´ múltiples. • Son genes que generalmente se transcriben a bajas tasas. • Presentan un segmento de 20 a 50 pb rico en GC • Este sitio es reconocido por un factor de transcripción llamado SP1

17. Islas CpG • Las secuencias ricas en CG son pocas en el genoma eucariótico • Estas regiones justo antes de un gen presentan una distribución no al azar. • Pueden ser identificadas por su susceptibilidad a la enzima de restricción HpaII. • La presencia de islas CpG sugiere una zona de iniciación de transcripción.

24. El enhancer del SV40 • Estimula la transcripción de proteínas virales en la infección. • Estimula la transcripción de todos los genes eucariontes en que se ha probado. • Funciona en cualquier orientación • Funciona hasta a miles de pares de bases de sitio de iniciación • Está compuesto de muchos elementos individuales que contribuyen individualmente a la actividad.

25. Características de los enhancers • Se han encontrado a más de 50 kilobases del promotor que controlan. • Pueden estar río arriba del promotor, río abajo del promotor, dentro de un intrón o de un exón o hasta después del último exón. • Algunos son específicos de un tipo celular. • En los genes de las inmunoglobulinas en los linfocitos B, hay un enhancer dentro del segundo intrón pero funciona solo en linfos B.

26. Elementos de control cercanos y lejanos • Se creía que eran diferentes • Se pueden invertir su colocación y siguen estimulando la transcripción. • Son célula específico • Ahora se piensa que son un espectro de elementos de control que regulan la transcripción.

28. Resumen • La expresión de los genes que codifican para proteínas en eucariontes están regulado por múltiples regiones de control que actúan en cis. • Algunos de estos elementos de control son cercanos al sitio de inicio y otros lejanos. • Los promotores determinan el sitio de inicio de transcripción y dirigen la unión de la RNA polimentasa II.

29. Resumen • Se han identificado tres tipos de secuencias promotoras en eucariontes. • Caja TATA • Promotores diferentes poco frecuentes • Islas CpG

30. Los elementos proximales • Están dentro de los ≈200 pares de bases. Contiene hasta 20 pares de bases cada uno.

31. Los enhancers, • Usualmente contienen entre 100 y 200 pb de longitud. Tienen elementos de control individuales de 8 a 20 pb. • Se localizan a más de 200 y hasta decenas de kilobases río arriba o abajo del promotor. • Puede estar dentro de un intron o más lejos del último exón del gen.

32. Aislamiento bioquímico de los factores de transcripción • Una vez que el elemento regulatorio se ha identificado por análisis mutacional, • Se puede: • Identificar a la proteína cognada que se une específicamente a ella. • En esta técnica, un extracto del núcleo se pasa por varias cromatografías y se realiza un footprinting con Dnasa tipo I o un ensayo de cambio en la movilidad electroforética (EMSA)

33. Las fracciones que contienen proteínas que se unen a elementos regulatorios probablemente contienen factores putativos de transcripción. • La técnica más poderosa para purificar factores de transcripción es la cromatografía de afinidad en dónde se inmovilizan las secuencias de los elementos regulatorios a un soporte.

35. Si la transcripción del gen reportero es mayor en presencia de l plásmido que codifica para la proteína X, esta es un activador. Si es menor, X es un represor.

40. Clasificación de los dominios de unión al DNA • Proteínas con: • Homeodominio • Proteínas con dedos de zinc • Hélice alada (en lengüeta de flecha) • Con cremallera o zipper de leucina • Con hélice-bucle-hélice

41. Homeodominio • Proteína de Engrailed de Drosophila • Nombre de genes homeóticos (produce la transformación de una parte del cuerpo en otro en el desarrollo. • Región de 60 residuos de aa muy conservada

44. Proteínas con dedos de zinc • Dominio estructurado con un ion Zn2+ en el centro de un plegamiento de residuos de aa. • Secuencia consenso Tyr/Phe-Cys-X2-4-Cys-X3-Phe/Tyr-X5-Leu-X2-His-X3-4-His • La forma de dedo se ve en un diagrama bidimensional • El zinc se fija entre las 2 Cys y la 2 His. • Se le llama dedo C2H2

45. Proteínas con dedos de zinc • El alfa-hélice que se forma es muy compacto • Se inserta en el surco mayor del DNA • Otro tipo de dedos de zinc C4 se encuentra en otros factores de trascripción (receptores a esteroides-nucleares) • Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys-X14-15-Cys-X5-Cys-X9-Cys-X2-Cys

46. Proteínas con dedos de zinc • Los dominios C2H2 y C4 son estructuralmente distintos. • Los C2H2 tienen tres dedos repetitivos o más y se fijan como monómeros. • Los C4 tienen en general dos dedos y se fijan como homodímeros o heterodímeros. • Con simetría rotacional doble (fig. siguiente b)

47. Dedos de zinc C2H2 (a)y C4(b) Proteína GL1 Receptor a glucocorticoides

48. Interacción entre Gal4 y el DNA • Proteína con dedos de zinc C6 . • Es un homodímero que se forma por una hélice enrollada .

49. Proteínas con hélice alada • Dominios de fijación de la histona H5 • Se unen al DNA como monómeros • Pueden unirse al DNA Z.

50. Estructura cristalina del dominio de unión al DNA Z de la proteína Dlm-1 unida al DNA.