Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble

1. ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble

2. Exposé • La cytogénétique et l’épigénétique des cancers • La méthylation des gènes suppresseurs de tumeur et les méthodes d’étude • Les épendymomes de l’enfant • Les neuroblastomes de l’enfant • Conclusions et Perspectives

3. La génétique et les cancers • Le cancer est une maladie génétique acquise • Altération au niveau de gènes suppresseurs de tumeur (GSTs) et oncogènes • Altérations inactivatrices • Délétion • Mutation • Translocation • Hypothèse de Knudson • Sélection d’un clone plus robuste • Avantage prolifératif

4. L’épigénétique • Altérations qui • ne changent pas la séquence de l’ADN • sont transmises au cours des divisions cellulaires • sont potentiellement réversibles. • Deux modifications principales: • Acétylation et méthylation des histones • Méthylation de l’ADN

5. 5-méthyl Cytosine NH2 C CH3 N C 5-mC C C O S-adenosylhomocysteine N ADN Méthyltrasferase S-adenosylmethionine Démethylase NH2 C N C C C C O N La méthylation de l’ADN • Définition: • L’addition d’un groupement méthyl au niveau du carbone 5 d’une cytosine dans un dinucléotide CpG • Les méthyltransférases (DNMT1, DNMT3a et DNMT3b) Cytosine

6. La méthylation de l’ADN • Les dinucléotides CpG sont peu fréquents dans l’ADN sauf dans les « îlots »CpGs • Plus grande part des « îlots » sont retrouvés dans la région promotrice des gènes • La méthylation pourrait entraîner la répression de la transcription de l’ADN • deux mécanismes possibles

7. Cytosine non méthylée Cytosine méthylée Promoteur Séquence codante Facteurs de transcription Mécanisme 1: la région promotrice

8. Histone Histone acétylée Histone déacétylée CpG non méthylée CpG méthylée Mécanisme 2: l’acétylation des histones

9. Méthylation et les processus physiologiques • Rôle important dans l’embryogenèse • 4-6% de toutes les cytosines sont méthylées chez l’adulte • Fonction normale comme • Inactivation des rétrotransposons • Inactivation du X • Empreinte parentale

10. Méthylation et carcinogenèse • Hypométhylation globale • Inactivation des gènes suppresseurs de tumeur par hyperméthylation • Nombreuses études dans les tumeurs de l’adulte

11. Intérêts de la méthylation • Compréhension des mécanismes du développement tumoral • Cible thérapeutique • Utilisation comme marqueur diagnostique et pronostique (suivi clinique)

12. Le profil de méthylation • Le gène ne doit pas être méthylé dans le tissu normal • Un type histologique donné ne peut pas être caractérisé par la méthylation d’un seul gène • Établissement difficile d’un profil spécifique d’une tumeur

13. Cancersde l’enfant et épigénétique

14. Les cancers de l’enfant • Rares • Morbidité et mortalité élevées • Caractéristiques particulières • Histologie différente • Comportement souvent très agressif • Souvent bonne réponse au traitement • Maladie du développement • Altérations épigénétiques moins étudiées

15. Epigénétique et tumeur solide de l’enfant

16. Epigénétique et tumeurs solides de l’enfant • Rétinoblastome • Rb1: rétinoblastomes unilateraux et sporadiques Zeschnigk et al., J Med Genet. 36:793-4, 1999. • Ostéosarcome • RASSF1A, TIMP3, MGMT, DAPK, p16: 93% Hou et al, Cancer 106 :1602-9, 2006.

17. Méthode d’étude: les gènes étudiés • 19 gènes suppresseurs de tumeur : • Gènes impliqués dans le cycle cellulaire (Rb1, p14 ARF, p15INK4b, p16INK4a) • Gènes impliqués dans l’apoptose (RASSF1A, DAPK, CASP8, DRC1, DRC2, FLIP) • Gènes de la réparation de l’ADN (MGMT) • Gènes impliqués dans l’angiogenèse, adhésion cellulaire et le remodelage tissulaire (APC, ECAD, TIMP3) • Autres (RAR b, FHIT, BLU, INI1, NF2)

18. BLU FHIT P16 APC RB DAPK MGMT NF2 INI1 EP300 Méthode d’étude: les gènes étudiés

19. Méthode d’étude • « Methylation specific PCR » (MSP) réalisée en deux étapes: • Traitement avec le bisulfite de sodium • PCR avec des amorces spécifiques

20. ADN modifié: Echantillon non méthylé: 5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’ Echantillon méthylé: 5’-UATGCGGTCGACGT- 3’ M M M Le traitement bisulfite Échantillon d’ADN: 5’-CATGCGGTCGACGT-3’ Traitement Bisulfite: Toutes les cytosines non méthylées sont transformées en uraciles.

21. Methylation-specific PCR Echantillon méthylé: 5’-UATGCGGTCGACGT- 3’ Echantillon non méthylé: 5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’ MSP avec les amorces Non methylé (U) et methylé (M) Amorce U: 3’- ATACACCAACTACA-5’ Amorce M: 3’-ATACGCCAGCTGCA-5’

22. Methylation-Specific PCR • Avantages: • Sensible • Facile • Inconvénient: • Non quantitative

23. Méthylation et épendymomes

24. Les épendymomes • Troisième tumeur du SNC chez les enfants • Pas de marqueur biologique connu • Facteurs pronostiques: âge et résection chirurgicale • Pas de réponse à la radiothérapie et à la chimiothérapie

25. Ependymomes et cytogénétique • Perte du chromosome 22q dans 23% des cas • Perte du chromosome 6q dans 15% des cas • Gain du 1q (20%) et altération du 17p (rare) • Mais 40% des ependymomes n’ont pas d’anomalie chromosomique • Pas d’association avec survie ou réponse au traitement

26. Nos hypothèses • Méthylation comme mécanisme d’inactivation des gènes localisés dans le bras long du chromosome 22 (INI1, NF2, TIMP3, EP300) • Profil épigénétique particulier • Relation entre la méthylation et la survie

27. Matériel • 27 épendymomes intracrâniens • 7 papillomes du plexus choroïde • 3 cortex adultes

28. Résultats

29. Résultats

30. Résultats

31. Discussion • Peu d’études réalisées • Différents gènes étudiés • Possibilité d’une relation avec l’âge du patient et la localisation tumorale • Enfant ≠ adultes • Intra-crâniennes ≠ rachidiennes

32. Discussion • Les voies de l’apoptose • Utilisation possible: • le diagnostic différentiel • la détection précoce d’une rechute • Autres gènes à étudier

33. Méthylation et neuroblastome

34. Les neuroblastomes • Le neuroblastome est la tumeur extra crânienne solide la plus fréquente chez les enfants de moins de 5 ans • La présentation clinique est très variable: de la régression spontanée à l’évolution métastatique rapide

35. Cytogénétique • La ploïdie • L’amplification de NMYC • La délétion du chromosome 1p et du 11q • La trisomie du chromosome 17q

36. Classification des neuroblastomes

37. Nos hypothèses • Méthylation : mécanisme d’oncogenèse dans les neuroblastomes • Profil de méthylation caractéristique des neuroblastomes • Profil particulier en fonction des différents stades cliniques

38. Matériel • 45 tumeurs primitives • 17 rechutes

39. Résultats

40. Résultats

41. Résultats

42. Résultats METHYLATION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES IN NEUROBLASTOMA: THE RASSF1A GENE IS ALMOST ALWAYS METHYLATED IN PRIMARY TUMORS. Pediatric Blood and Cancer En cours de soumission après revision du manuscrite.

43. Discussion • CASP8 • La méthylation inhibe l’expression du gène dans des lignées cellulaires Teitz et al., Nat Med 6:529–35, 2000. • La voie TRAIL • Différence de profil de méthylation entre les ganglioneuromes et les neuroblastomes • Rétablissement de ces gènes après traitement avec des agents déméthylants Banelli et al., Cancer Lett 228:37-41, 2005. • RASSF1 • Méthylé dans 100% des lignées cellulaires • Corrélation avec la méthylation de CASP8 • Possibilité d’un sous-type de neuroblastome Yang et al., Clin Cancer Res 10:8493-500, 2004.

44. Conclusions et Perspectives

45. Conclusions • Étude de la méthylation de l’ADN dans les épendymomes et les neuroblastomes • Suggestion d’un profil spécifique • Dans le cas des épendymomes: • Altération épigénétique dans les voies d’apoptose présente dans les tumeurs bénignes (papillome du plexus choroïde) • Dans le cas des neuroblastomes: • Altérations liées au stade clinique dans les neuroblastomes • Possibilité d’une relation avec l’évolution tumorale

46. Perspectives • Plus grand nombre de tumeurs • Autres tumeurs • Application de méthodes quantitatives • ADN dans le sang et le liquide céphalorachidien • Collaboration avec d’autres centres et comparaison avec les données cliniques et génétiques

47. Perspectives • Méthylation comme marqueur diagnostique et/ou pronostique • Utilisation thérapeutique • agents déméthylants • association de la méthylation et la résistance au traitement

48. Remerciements

49. Remerciements • Les directeurs de thèse: • Mr Plantaz et Mme Favrot • Les rapporteurs: • Mr Chastagner et Mr Dellatre • Mlle Florence de Fraipont • Le gouvernement du Brésil (CNPq) “Ministère de la Science” • Les techniciennes du laboratoire et l’UF Cancérologie et Biothérapie • Le Service de Pédiatrie du CHU de Grenoble

50. LES QUESTIONS