Физическая химия биополимеров Лаврик О.И.

1. Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012

2. 5. Аллостерические ферменты. Функциональные димеры, механизм их функционирования

3. Аллостерические ферменты

4. Аллостерическиеэффекторы Положительные Аллостерические активаторы Отрицательные Аллостерические ингибиторы Снижают активность фермента Повышают активность фермента Гомотропнаярегуляция– аллостерическая регуляция, когда субстрат может выступать в качестве эффектора (эффектор и субстрат - одно и то же вещество).

5. Функционирование аллостерических ферментов, при взаимодействии с аллостерическим ингибитором (А) и аллостерическим активатором (Б)

6. Аспартат карбамоил-трансфераза (АКТ-аза) АКТ-аза – фермент биосинтеза пиримидинов, обеспечивает образование карбамоиласпартата – одного из промежуточных продуктов синтеза СТР. Карбамоил- фосфат L-аспартат карбамоиласпартат Бактериальная АКТ-аза E. coli 6 каталитических субъединиц (34 кДа, 2 тримера) 6 регуляторных субъединиц (16 кДа, 3 димера)

7. Работа регуляторных субъединиц АКТ-азы Регуляторные субъединицы СTP Аллостерический ингибитор АТР Аллостерический активатор Протекание реакции во времени приводит к появлению СTP – конечного продукта цепи. По мере накопления СTP и его связывания с ферментом сродство к субстратам снижается и фермент включается в работу только при гораздо больших концентрациях субстрата. АТР конкурирует с СTP и может устранять его ингибирующее действие. Регуляция является обратимой и при изменении в клетке концентрации АТР или СTP скорость работы фермента изменяется. Таким образом АКТ-аза обеспечивает постоянное присутствие в клетке нужных количеств СТР.

8. р-ClHg-бензоат Две –SH группы остатков Cys на каждую регуляторную субъединицу Номер фракции Разделение каталитических и регуляторных субъединиц аспартат карбамоил-трансферазы (АКТ-азы) на анионообменнике в градиенте соли KCl. Первый пик (1) – каталитические субъединицы, второй пик (2) – регуляторные субъединицы.

9. S-образная кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата Впервые S-образные функции для насыщения были получены в 1909 году (А. Хилл) Арчибальд Хилл 1886-1977 Английский физиолог Нобелевская премия по физиологии и медицине 1922 г. График зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в виде S-образной кривой на примере АКТ-азы: без эффектора, с АТР, с СTP. Субстрат – аспартат.

10. Кооперативное связывание Аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие эффектора с аллостерическимцентром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и к изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента.

11. Коэффициент Хилла h – безразмерная величина, характеризующая кооперативность связывания лиганда ферментом Y – степень насыщения, [L] – равновесная концентрация лиганда и [L]0,5 – равновесная концентрация лиганда, при которой Y=0,5 от максимального насыщения. Vmax – максимальная скорость при S0→∞, [S]0,5 – концентрация субстрата при половине максимальной скорости, которая входит в уравнение вместо константы Михаэлиса KМ.

12. Графическое определение коэффициента Хилла lg(v/( Vmax-v)) = hlg[S0] – hlg[S]0,5

13. Для изостерических ферментов, у которых кооперативного взаимодействия между активными центрами нет, то есть сродство фермента к субстрату не зависит от уже присоединенных молекул субстрата, h=1. Положительная кооперативность (h>1) характеризуется тем, что присоединение одной молекулы субстрата к активному центру фермента увеличивает сродство к субстрату остальных активных центров. S-образные кривые зависимости скорости реакции от концентрации субстрата характерны для положительной кооперативности. Связывание кислорода с гемоглобином, имеющим 4 центра связи, характеризуется параметром Хилла h=2,9. Отрицательная кооперативность (h<1) характеризуется тем, что присоединение одной молекулы лиганда к активному центру фермента уменьшает сродство к лиганду остальных активных центров.

14. Конформационные состояния и возможные переходы между ними при аллостерических взаимодействиях протомеров тетрамерного белка Конформации белка, соответствующие диагонали, проведенной из верхнего левого угла в правый нижний, представляют собой состояния, для которых переход из одного в другое индуцируется лигандом

15. АКТ-аза: субстрат и эффекторы влияют на равновесие между Т- и R-формами и тем самым на сигмоидность кривой. С возрастанием концентрации аспартата равновесие смещается к R-форме. АТР стабилизирует R-состояние путем связывания с регуляторной субъединицей. Напротив, присоединение СTP содействует переходу в Т-состояние. Белковый олигомер может находиться в одном из двух состояний: Т-состоянии (от англ. tense – напряженное) и R-состоянии (от англ. relaxed – расслабленное).

16. Функциональные димеры

17. Примеры структур функциональных димеров α2 α4 α2β2

18. Ассоциация мономеров позволяет уменьшить объем гидрофобной поверхности белка, и это более экономично провести через ассоциацию мономеров, чем путем увеличения молекулярного веса белка в пересчете на активный центр. Это позволяет организовать в олигомер субъединицы различной химической природы, на которых в случае регуляторных ферментов можно расположить аллостерически активные центры и регуляторные участки, и тем самым разделить их в пространстве. Жак Люсьен Моно 1910, Париж – 1976, Канн французский биохимик и микробиолог Нобелевская премия по физиологии и медицине 1965 г.

19. Ряд ферментов-олигомеров подчиняется Михаэлисовской кинетике и проявляет свойство отрицательной кооперативности при связывании субстратов Возможные причины ухудшения связывания второго субстрата для фермента, состоящего из двух субъединиц: Активные центры, расположенные на субъединицах, изначально неравноценны. Центры изначально равноценны, но их неэквивалентность возникает в результате гетерологической укладки субъединиц. Один из центров экранирован, сродство фермента ко второму субстрату снижается по стерическим причинам. Изменение структуры второго центра приводит к уменьшению сродства фермента к субстрату в результате конформационных взаимодействий субъединиц.

20. Механизм реакционной способности половины активных центров (half-of-the-sites reactivity) Отрицательная кооперативность для ферментов, подчиняющихся Михаэлисовской кинетике, может проявляться не только при связывании субстратов, но и в процессе формирования продуктов реакции. При механизмереакционной способности половины активных центров только один активный центр функционирует в единицу времени и продукт формируется на 1 центре фермента.

21. Щелочная фосфатаза E.coli E + ROPO32-E~O-PO32- + ROH E + HPO42- • Димер с молекулярным весом 94 кДа. • Гидролаза, дефосфорилирующая многие типы молекул, • например, нуклеотидов, белков и алкалоидов. • Проявляет наибольшую активность в щелочной среде. • На каждой субъединице имеет три центра связывания • двухвалентных металлов Zn2+, а также Mg2+, Co2+, Cd2+ • и др., из которых два являются прочно связывающими.

22. Щелочная фосфатаза E.coli Имеет ли место отрицательная кооперативность при образовании ковалентных производных? Фосфорилирование гидроксильной группы остатка серина происходит как при взаимодействии с субстратом, так и с продуктом реакции. Нековалентное связывание ортофосфата с Zn2+ идет по двум центрам фосфатазы. Соответствующие константы диссоциации отличаются на порядок, что обусловлено выраженной отрицательной кооперативностью связывания.

23. Щелочная фосфатаза E.coli Отрицательная кооперативность была обнаружена в кислых рН, когда ковалентные производные устойчивы. При фосфорилировании второго центра концентрацию [32Р]-ортофосфата повышали: при рН 4,2 в 20-40 раз, при рН 5 на три порядка. Фосфорилирование активных центров Zn2+ препаратов фосфатазы При щелочном рН, которое оптимально для катализа, обнаруживается фосфорилирование фермента строго по одному центру.

24. Щелочная фосфатаза E.coli *Е и **Е указывают на внутри и межсубъединичные взаимодействия соответственно. *E-S – нековалентное присоединение субстрата, Е-Р или * Е-Р – ковалентное фосфорилирование. Межсубъединичные взаимодействия необходимы как для фосфорилирования (*Е), так и для дефосфорилирования (**Е). Внутрисубъединичная кооперативность обуславливает фосфорилирование, а межсубъединичная – дефосфорилирование.

25. Щелочная фосфатаза E.coli Реакция может быть представлена в виде следующей схемы (графа): Для этой схемы: V =

26. В случае функционального димера на 1 моль фермента может приходиться 2 или 1,5 моль субстрата. Связывание менее двух молей субстрата на моль фермента можно наблюдать, когда вторая молекула субстрата связывается с ферментом с меньшим сродством. Действующими являются оба активных центра, но активность второго во время функционирования первого подавляется. При связывании двух субстратов, как правило, Kd(2) >> Kd(1): для первого субстрата Kd(1)=[E][S]/[ES], для второго субстрата Kd(2)=[E][ЕS]/[ES2]. Функциональная димерность фермента нужна в основном для повышения числа оборотов ферментативной реакции, то есть для повышения каталитической активности фермента.