Irma Otrębska

1. Wyjście mysich oocytów z II metafazy wymaga nienaruszonego wrzeciona podziałowego podczas wewnątrzkomórkowego wzrostu stężenia wapnia Nicola J. Winston, Orla McGuinness, Martin H. Johnson, Bernard Maro – 1995 rok, journal of cell science Irma Otrębska

2. Co wiemy do tej pory? • Dojrzałe, owulowane oocyty zatrzymują się w II metafazie dopóki nie zostaną aktywowane lub zapłodnione • Pociąga to za sobą serię oscylacyjnych zmian stężenia jonów wapnia • Wzrost stężenia wapnia powoduje inaktywacje MPF • Cyklina jest regulatorowym substratem MPF i jej destrukcja jest wymagana do wyjścia z metafazy • Do degradacji cykliny B niezbędna jest obecność nienaruszonego wrzeciona podziałowego, ponieważ w obecności nokodazolu poziom degradacji cykliny spada.

3. Nokodazol • Działa depolimeryzująco na mikrotubule komórek • Wejście w interfazę może być opóźnione jeżeli oocyty zostaną zapłodnione w obecności nokodazolu • Wrzeciono podziałowe ulega degradacji, a chromosomy ulegają rozproszeniu • Usunięcie nokodazolu powoduje gromadzenie się wokół grup chromosomów skupisk mikrotubul • Każde powstałe wrzeciono kończy podział i odłączanych jest wiele ciałek kierunkowych • Oocyt przechodzi w interfazę • W przypadku aktywacji, np. etanolem oocyty nie kontynuują mejozy samoistnie

4. kontrola 1 minuta

5. 3 minuty 6 minut

6. Materiały i metody • od sześcio- do dziesięcio- tygodniowe samice • Dootrzewna iniekcja PMSG 48h przed sekcją • hCG 13 godzin przed sekcją • Komórki pęcherzykowe usunięte przez hialuronidazę • Osłonki przejrzyste usunięte przez Tyrode • Hodowane in vitro w pożywce M2+BSA • Barwienia immunocytochemiczne • Badanie aktywności kinazy histonu H1 • Badanie poziomu wapnia wewnątrz komórki fura-2 (barwnik fluoroscencyjny wiążący się w wolnymi jonami wapnia)

7. Aktywacja etanolem • Oocyty były hodowane jeszcze przez 5 godzin po izolacji, a potem podzielone na 6 grup

8. Brak aktywacji w grupie kontrolnej i u tych oocytów które wcześniej były poddane działaniu nokodazolu • O połowę zmalał poziom aktywacji między aktywowanych etanolem, a etanolem z dodatkiem nokodazolu kontrola Po 60 minutach

9. Oocyty pozostawiono w M2+BSA na godzinę i znowu poddano aktywacji • Zaobserwowano drugie uwolnienie wapnia • Oocyty zostały aktywowane i wyrzuciły II ciałka kierunkowe, co zostało potwierdzone po wybarwieniu preparatów (oocyty były w telofazie)

10. Aktywność kinazy histonu H1 • Kinaza odpowiadająca za kondensację chromatyny • Wysoka aktywność w nieaktywnych oocytach • Spada gwałtownie po aktywacji • Oocyty po inkubacji z nokodazolem nie wykazują spadku aktywności • Po godzinnej inkubacji w zwykłej pożywce, i po kolejnej aktywacji etanolem, aktywność kinazy spada

11. Zapłodnienie w obecności nokodazolu • Oocyty w obecności nokodazolu uległy zapłodnieniu, ale nie opuściły metafazy jeśli ich nie przeniesiono do czystej pożywki • Wtedy • Wyrzucają liczne ciałka kierunkowe i tworzą przedjądrza • Wrzeciona odtwarzane są w przeciągu godziny • Poziom wapnia zmienia się w oocycie zapłodnionym w obecności nokodazolu w bardzo podobny sposób jak w kontroli bez nokodazolu.

12. Oocyt nie zapłodniony inkubowany z nokodazolem a potem przeniesione do zwykłej pożywki Oocyt nie zapłodniony Zapłodniony oocyt Oocyt zapłodniony w pożywce z nokodazolem i przeniesiony do czystej pożywki

13. Zablokowanie wzrostu stężenia wolnych jonów wapnia • Oocyty zostały podzielone na dwie grupy • 1- przeniesione bezpośrednio po zapłodnieniu do pożywki zawierającej BAPTA-AM (bufor zapobiegający zmianom stężenia wapnia) • 2- najpierw przeniesione do pożywki z nokodazolem, bez wapnia (by wyczerpać wewnątrzkomórkowe zasoby tego pierwiastka). Potem do pożywki bez wapnia.

14. 1 • Tylko dwa z 249 wyszły z metafazy po 6 godzinach inkubacji • Oocyty znakowane fura pokazały że po przeniesieniu do BAPTA poziom wapnia przestał się zmieniać • Chromosomy we wszystkich oocytach były podzielone na grupy i skondensowane • Każda grupa zgromadziła wokół siebie mikrotubule, ale nie uformowało się prawidłowe wrzeciono

15. Ten sam eksperyment powtórzono z dodatkiem cytochalazyny D podczas inseminacji (zapobiega rozejściu się chromosomów) • Powstało wrzeciono podziałowe ale w lekko nieprawidłowym kształcie • Tylko 1% oocytów wyszło z metafazy na 186 w porównaniu z kontrolą 51/196 (26%) +BAPTA +cytochalazyna D

16. 2 • Grupa znajdująca się w pożywce bez wapnia • Po godzinie część oocytów została przeniesiona z powrotem do zwykłej pożywki • 29% po pięciu godzinach inkubacji przeszło do interfazy • W oocytach zatrzymanych w II metafazie powstały 3,4 skupiska chromosomów każde z własnym wrzecionem podziałowym Oocyty zatrzymane w metafazie II Oocyty które wyszły z metafazy

17. Znakowanie fura • Przeniesienie oocytów z powrotem do pożywki z wapniem spowodowało powrót zmian stężenia wapnia (8/10) • Dwa z nich wyrzuciły drugie ciałka kierunkowe

18. Wnioski • Oocyty inseminowane w obecności nokodazolu, czyli takie które nie utworzyły wrzeciona podziałowego, nie wychodzą z metafazy II • Nie wytwarzanie wrzeciona nie działa hamująco na zmiany stężenia wapnia • Usunięcie z nokodazolu powoduje możliwość wznowienia cyklu mejotycznego • W oocytach inseminowanych cały czas po przeniesieniu trwają zmiany stężenia wapnia i nie potrzebują żadnego dodatkowego bodźca do przejścia do interfazy • Oocyty wcześniej aktywowane etanolem, żeby kontynuować podział, muszą być aktywowane jeszcze raz • Przy braku wapnia i usunięciu nokodazolu, wrzeciona podziałowe zostały odnowione, ale mejoza nie była kontynuowana • Po przeniesieniu do pożywki z wapniem oocyty przechodzą do mejozy

19. Wnioski 2 • Do wyjścia z metafazy wymagana jest degradacja cykliny i dezaktywację MPF • Degradacja cykliny B wymaga obecności wrzeciona i jest kontynuowana podczas trwania metafazy II na podobnym poziomie, i jest rekompensowana jednoczesną syntezą • Wapń nie rozpoczyna degradacji cykliny, a raczej podnosi jej poziom • Inseminowane oocyty „ pamiętają o aktywacji” . Cały czas obserwowane są skoki stężenia wapnia • Aktywacja mechanizmu degradacji cykliny zachodzi tylko podczas podwyższonego stężenia wapnia

20. Dziękuje za uwagę!