עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגן TALIN , מאקסון 34 עד לסוף אקסון 36 .

1. תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומביננטי עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגןTALIN, מאקסון 34 עד לסוף אקסון 36. הרצף המופיע בתמונה 1 הוא גדיל הסנס של הרצף הגנומי העומד לרשותך. יש לציין כי בתוך רצף זה קיימים (בצורה טבעית) הרצפים של אנזימי הרסטריקציה HindIII ו- KpnI, שימו-לב איזה אנזימי רסטריקציה קיימים במעבדה! (1 כיצד תשבט את אקסון 34 עד לסוף אקסון 36 של הגן TALIN, כך שבסוף השיבוט ניתן יהיה לשעתק (טרנסקריפציה) את הגן דרך הפרומוטר של SP6: פרט כל שלב ושלב לפי הסעיפים הבאים: • א) רשום את רצפי שני הפריימרים, הוסף לפריימר את אנזים הרסטריקציה המתאים לשיבוט, מה יהיה הרצף של אנזים הרסטריקציה לאחר החיתוך? • ב) איך יראו קצוות הפלסמיד לאחר החיתוך בשני אנזימי הרסטריקציה – נא להציג באיור. • ג) רשום איך מתבצעת ראקציית ה-PCR: באיזה חומרים משתמשים ואיך עובד מכשיר ה-PCR? • ד) לאחר חיתוך הפלסמיד וחיתוך תוצר ה-PCR שקיבלת, עליך להמשיך בשיבוטו. איך מתבצע תהליך השיבוט – פרט את כל השלבים והחומרים בהם תשתמש. 2) איך תבדוק כי המושבה שקיבלת אכן מכילה את תוצר השיבוט- פרט את כל האפשרויות. 3) השיבוט שלך הצליח, אך כעת מתברר לך כי עליך להוסיף לפלסמיד המשובט עוד 100 בסיסים של רצף אינטרוני במורד אקסון 36 , הרצף מופיע בתמונה מספר 1 (לא לשבט את כל המיניגן מחדש), מה תעשה? • א) רשום את הפריימרים בעזרתם תסנטז בסיסים אלו. • ב)באיזה אנזימי רסטריקציה תשתמש? הוסף לפריימרים את אנזימי הרסטריקציה המתאימים אחרי החיתוך. • ג) רשום איך יראה הפלסמיד החתוך כעת- באיזה אנזימי רסטריקציה בחרת להשתמש ומדוע דווקא בהם? החומרים והמכשירים העומדים לרשותך במעבדה הינם (לא כל החומרים כתובים): • פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש באתר ה- polylinker תמונה 2. • חמישה אינזימי חיתוך (רסטריקציה) ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3. • DNA taq polymerase • במעבדה ישנו מכשיר PCR, קיט תעשייתי להפקת פלסמיד (מאפשר להפיק פלסמיד מכמות גדולה של חיידקים) . • הערה: ראקציית ה- PCR מתבצעת ע"י ערבוב החומרים והכנסתם למכשיר ה- .PCR

2. תמונה 1: TALIN רצף גנומי חלקי של הגן Exon – Blue upper case (first exon is number 34) Intron – Black lower case

3. polylinker תמונה 2: פלסמיד השיבוט

4. BamHI G 3’ ACGTC 5’ C 3’ CATGG 5’ GATCC 3’ G 5’ AATTC 3’ G 5’ AGCTT 3’ A 5’ 5’ G 3’ CTTAA 5’ A 3’ TTCGA 5’ CTGCA 3’ G 5’ G 3’ CCTAG 5’ GGTAC 3’ C 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ A AGCT T 3’ 3’ T TCGA A 5’ 5’ G GATC C 3’ 3’ C CTAG G 5’ HindIII EcoRI KpnI 5’ G GTAC C 3’ 3’ C CATG G 5’ 5’ C TGCA G 3’ 3’ G ACGT C 5’ PstI האנזימים הקיימים במעבדה: