ABP 34-36

1. ABP 34-36 ABP B Marcel Costa García Clara Domingo García Alba Girbau Canet Marta Inglés Ferrándiz Carlos Pardo Pastor Karen Roqueta Capilla Marc Sitges Puy Neus Solé Morata • Aprenent de l’estudi clínic del TGN1412

2. Índex • La presentació del cas • TGN1412 • CD28 • Hipòtesis • Mala humanització • Interacció TGN1412-CD28 • Interacció TGN1412-CTLA4 • Siglecs • Interacció FcTGN1412-FcgR • Monòcits • Conclusions • Referències • Preguntes PEM

3. Presentació del cas

4. Presentació del cas • TGN1412 • Superagonista:no necessita activació TcR, promou proliferació de limT. • Monoclonalanti CD28 isotip IgG4-κ. • Humanitzat per CDRgrafting del model murí.

5. Presentació del cas • TGN1412 Fracció antigen-binding (Fab) Fracció cristal·litzable (Fc) Cadena Pesada (HC) Cadena Lleugera (LC) Domini Constant Domini Variable

6. Presentació del cas • CD28 • Media adhesió i coestimulació de les cèl·lules T naive amb les cèl·lules APC. • TGN1412 s’hi uneix per un epítop concret (C’’D loop) limT CD28 CTLA4 CD80 CD86 APC

7. Hipòtesis • Plantejament hipòtesis 6 4 2 3 1 5

8. Hipòtesis • Hipòtesi 1: Mala humanització

9. Hipòtesis • Hipòtesi 1 Abhinandan K. Raghavan. Sequence and structural analysis of antibodies[dissertation]. Universitycollege London: UCL Research Department of Structural and Molecular Biology; 2009.

10. Hipòtesis • Hipòtesi 1 Taula comparativa de les dades d’AAR (Hwang and Foote (2005)) respecteels scores de humanness de diferentsanticossosmonoclonalshumanitzats I quimerics (Abhinandan K. Raghavan. Sequence and structural analysis of antibodies [dissertation])

11. Hipòtesis • Hipòtesi 1 ...The light chain has a similar humanness score to the best humanized antibody (Herceptin), while the heavy chain is much higher than the score for Synagis, both very well tolerated. Thus, before more information on the mode of action of TGN1412 became available, we were able to conclude that it was unlikely that the immune response seen in the six volunteers was a reaction to the humanized antibody itself...

12. Hipòtesis • Hipòtesi2: Interacció TGN-CD28

13. Hipòtesis • Hipòtesi 2 HIPÒTESI 2: La Interacció entre TGN1412 i el CD28 podria ser molt diferent a la del 511A1 degut als canvis que s’han introduït a la molècula (humanització). Partim de: • Els CDR (ComplementaryDetermining Regions) de TGN1412 i 511A1 són idèntiques (hipotètica regió d’interacció) • El CD28 de macac i humà són idèntiques en la regió extracel·lular (la que interacciona i està cristal·litzada). Que volem analitzar? • Residus implicats en la interacció 511A1 - CD28 vs. Residus implicats en la interacció TGN1412 - CD28 • Energia d'unió en cada cas Necessitem conèixer l’estructura tridimensional del TGN1412

14. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Com podem conèixerl’estructura d’una proteïna? • Determinaciód’estructures: mètodesexperimentals • Predicciód’estructures: mètodescomputacionals

15. Hipòtesis • Hipòtesi 2

16. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Dicroïsme circular • Es basa en la absorció diferent per part de les molècules quirals de les ones polaritzades circularment (RCP i LCP).

17. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Dicroïsme circular • Ultraviolat llunya (190-250 nm) • El cromòfor és l’enllaç peptídic • Informació sobre l’estructura secundària

18. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Dicroïsme circular • Avantatges • És un mètode ràpid i barat • No requereix gran quantitat de proteïna • No genera grans quantitats d’informació a processar • Es poden analitzar diverses condicions de solució, temperatura, pH...

19. Hipòtesis • Hipòtesi 2 AVANTATGES INCONVENIENTS

20. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Perquè necessitem mètodes computacionals? Els mètodes experimentals: - Cars - Lents - Hi ha proteïnes que no s’han aconseguit cristal·litzar.

21. Hipòtesis • Hipòtesi 2 Predicció computacional: què ens permet predir l’estructura mitjançant computació? • El nombre de plegaments és finit • Homòlegs >30% d’identitat en seqüència conserven estructura. • Existeixen un gran nombre d’estructures determinades experimentalment (i d’accés públic)

22. Hipòtesis • Hipòtesi 2 HIPÒTESI 2: La Interacció entre TGN1412 i el CD28 podria ser molt diferent a la del 511A1 degut als canvis que s’han introduït a la molècula (humanització). Partim de: • Els CDR de TGN1412 i 511A1 són idèntiques (hipotètica regió d’interacció) • El CD28 de macac i humà són idèntiques en la regió extracel·lular (la que interacciona i està cristal·litzada). Que volem analitzar? • Residus implicats en la interacció 511A1 - CD28 vs. Residus implicats en la interacció TGN1412 - CD28 • Energia d'unió en cada cas Necessitem conèixer l’estructura tridimensional del TGN1412

23. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Como ho avaluem? Fem modelatge per homologia del TGN1412 Templates utilitzats: • Per modelar les CDR: • 511A1 (1YJD): fragment Fab d’un anticòs de ratolí. 100% d'identitat en les CDR • Per modelar la resta de la cadena: • Busquem homòlegs mitjançant BLAST 1YJD

24. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Buscant homòlegs per a cada una de les cadenes HC: 1hzh LC: 1bey

25. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 TGN1412: Cadena Pesada (HC) 1HZH

26. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 TGN1412: Cadena Lleugera (LC) 1BEY

27. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Creem el model... Generem el modelmitjançant MODELLER: obtenim 2 models

28. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Models Cadena Pesada (HC) Model 1 Model 2

29. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Models Cadena Lleugera (LC) Model 1 Model 2

30. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Creem el model... Generem el modelmitjançant MODELLER: obtenim 2 models Unim les duescadenesamb STAMP i minimitzemelsmodelsmitjançant NAMD

31. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 TGN1412

32. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 Creem el model... Generem el modelmitjançant MODELLER: obtenim 2 models Unim les duescadenesamb STAMP i minimitzemelsmodelsmitjançant NAMD Analitzemelsmodels, comparant-los ambelsseustemplatesamb PROSAII i PROCHECK.

33. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 ANÀLISI MODELS CADENA LLEUGERA TGN1412-1TGN1412-2 1HZH1YJD

34. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 ANÀLISI MODELS CADENA PESADA TGN1412 1HZH 1YJD

35. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 PROCHECK TGN1412

36. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 PROCHECK 511A1

37. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 PROCHECK 1HZH

38. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Modelatge TGN1412 PROCHECK 1BEY

39. Hipòtesis • Hipòtesi 2

40. Hipòtesis • Hipòtesi 2

41. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Interacció 5.11A1/TGN1412 – CD28

42. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Interacció 5.11A1/TGN1412 – CD28

43. Hipòtesis • Hipòtesi 2

44. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Conclusions • Interacció TGN1412-CD28 predita per PISA aproximadament igual de forta que 511A1-CD28. • Mateixos enllaços implicats (interacció gairebé idèntica) • Resultat previsible: Hem utilitzat com a “template” 5.11A1 tan per predir el TGN1412 com orientar-lo en l’espai respecte a CD28) • Incloure com a “templates” 1BEY/1HZH no modifica la interacció. • Cal realitzar altres tipus de prediccions i/o simulacions més llargues.

45. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Regió transmembrana

46. Hipòtesis • Hipòtesi 2 • Regió transmembrana TMHMM Jpred Psipred

47. Hipòtesis • Hipòtesi3: TGN1412-CTLA4

48. Hipòtesis • Hipòtesi 3 • Observació • “...CD28 and CTLA-4 play antagonistic roles in the regulation of T cells, maintaining a fine balance between CD28-mediated activation and CTLA-4-mediated inhibition of T cell activation …” • “… Similarly to CD28, the cell surface protein CTLA-4 also binds CD80/CD86...” L. Farzaneh, N. Kasahara and F. Farzaneh The strange case of TGN1412, Cancer Immunology, Immunotherapy, Volume 56, Number 2, 129-134, DOI: 10.1007/s00262-006-0189-8

49. Hipòtesis • Hipòtesi 3 • Observació DOMINIS DE DIMERITZACIÓ ZONA D’UNIÓ A CD80 I CD86

50. Hipòtesis • Hipòtesi 3 • Observació HOMOLOGIA ESTRUCTURAL