Application of Directly Coupled HPLC-NMR-MS to the Identification and Confirmation of Quercetin Glycosides and Phloret

Application of Directly Coupled HPLC-NMR-MS to the Identification and Confirmation of Quercetin Glycosides and Phloretin Glycosides in Apple Peel 분야 : HPLC-(NMR)-MS 발표자 : 석사1기 이 강진

목 차 • 기기 개요 • Appele peel의 성분 • 분석조건 • 분석결과 • 고찰 • 참고문헌

기기 개요 - I 가. 고전적 natural product 검색 방법 • Preparation of extracts • Test their pharmacological activity • Isolate individual components of the ext’s using liquid chromatography • Perform structure elucidation by NMR and MS off-line  Very tedious and time-consuming procedure

기기 개요 - Ⅱ 나. 고전적 방법의 개선 노력 (On-line technique) • HPLC-UV detector • - 물질의 분리와 검출에 일반적으로 사용 • - polar, nonvolatile, unstable componets 에 적합 • - 물질의 구조에 대한 data 제공에 부적함 • HPLC-UV-MS • - 분리된 물질의 분자량 추정 가능 • HPLC-UV-NMR - nanogram range 에서도 분석 가능 • HPLC-UV-NMR-MS - fast separation and structure elucidation

기기 개요 - Ⅲ 다. 일반적 HPLC-NMR-MS 의 구조

기기 개요 - Ⅳ 라. MS 의 구조

Apple peel 의 성분 - Ⅰ • 대부분이 Falvonoids - quercetin O-glycosides (rutin, hyperin, isoquercetin, reynoutrin, avicularin, quercitrin) - phloretin O-glycosides (phloridzin)

Apple peel 의 성분 - Ⅱ • Mass spectral fragmentation pathway of flavonoids RDA (retro-Diels-Alder) cleavage

분석 조건- Ⅰ 가. Apple peel extrat 준비 2.5g apple peel + 12.5 mL MeOD/D2O ↓ 90℃ 에서 15분간 추출 ↓ 원심분리 ( 10 min at 3,000g ) ↓ 감압농축하여 MeOD에 녹임

분석 조건- Ⅱ 나. HPLC 조건 • Column : Reverse phase C18 column • (250 X 4 mm, paricle size 5μm, Merck) • Column temp. : 35 ℃ • Flow rate : 1.0 mL/min • Injection volumn : 100 ul • Mobile phase : gradient between • D2O(0.1% trifluoro acetic acid) and acetonitril • Diode array detector : 280 nm (phloretin glycoside) • 370 nm (quercetin glycoside)

분석 조건- Ⅲ 다. 1H-NMR Detection • 500 MHz • Temperature : 30 ~ 37 ℃ • 1D TOCSY (pulse program selmp, Bruker), 128 scans 라. MS Detection • Scan range : 100 ~ 700 m/z

분석 결과 • HPLC-MS analysis of apple peel extract

고찰 • laboratory fractionation 및 purification 필요 없음 • 극미량 (a few microgram)의 시료로도 성분의 분석과 • 구조 규명이 가능 • 실험 시간의 단축 및 보다 정확한 물질에 대한 • 정보 획득 가능 • flavonoid algycone 및 그의 conjugates 동정에 • 꼭 필요한 방법

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