Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC

1. Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC

2. Posttranslační modifikace jsou běžnou záležitostí • Fosforylace transkripčních faktorů (viz jaderná lokalizace Swi5 z minula) • Fosforylace CDK samotných • Ale fosforylací možnosti nekončí ... vazba dalších podjednotek, ubikvitinace, degradace ...

3. R H O H C N C C C N C H O O H R O P O- O O- Fosforylace proteinů obecně - rekapitulace CH CH2 OH CH3 OH OH S, Ser T, Thr Y, Tyr CH2 CH CH3 CH3 CH3 CH2 A, Ala V, Val C O O- H, His Q, Glu F, Phe

4. wee mutanti S. pombe wt cdc2-w wee1: tyrosin kináza cdc25: fosfatáza, opačný fenotyp! (... mik1!) dvojitý mutant wee1 cdc25?? (P. Nurse et al.)

5. Substrátem Wee1 a Cdc25 je CDK! cdc13 (G2 cyklin) cdc25 cdc13 (G2 cyklin) cdc2 cdc2 wee1/mik1 Y15 Y15 - P nim1

6. CDC25 obvod je evolučně starý (aspoň u opisthokont) • Aspergillus: NimT (Nim/Bim terminologie ...) • S. cerevisiae má ... ale fenotyp?? • na první pohled nic • ALE víc dvojjaderných buněk – kontrola kvality (pučení) • HeLa: Y15F – předčas. vstup do mitosy!! • Xenopus: Y15 P ace nutná pro blok mitosy po aphidicolinu • Rostliny???

7. (Simpson and Roger, Curr. Biol. 14:R693, 2005)

8. Exprese kvasinkového Cdc25 v rost. buňkách má fenotyp (Orchard et al. ... Suchomelová, Lipavská ... 2005)

9. CDC25, Ostreococcus Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gb|AAQ16122.1| dual specificity phosphatase Cdc25 [Ostreoco... 795 0.0 gb|AAH02287.1| Cdc25b protein [Mus musculus] 112 2e-23 ref|NP_075606.1| cell division cycle 25 homolog B [Mus musc... 112 2e-23 gb|AAH57568.1| Cdc25b protein [Mus musculus] >gi|26335863|d... 112 2e-23 ref|XP_331695.1| hypothetical protein [Neurospora crassa] >... 111 4e-23 ref|NP_598255.1| cell division cycle 25A [Rattus norvegicus... 109 1e-22 ref|NP_598256.1| cell division cycle 25B [Rattus norvegicus... 109 1e-22 gb|AAR26469.1| cell division cycle 25B [Homo sapiens] >gi|1... 109 1e-22 gb|AAB21139.1| p63 [Homo sapiens] 109 1e-22 ref|NP_068658.1| cell division cycle 25B isoform 2 [Homo sa... 109 1e-22 ref|NP_004349.1| cell division cycle 25B isoform 1 [Homo sa... 109 1e-22 gb|AAH09953.1| CDC25B protein [Homo sapiens] >gi|11641413|r... 109 1e-22 ref|NP_997695.1| cell division cycle 25B isoform 5 [Homo sa... 109 1e-22 gb|AAP36368.1| Homo sapiens cell division cycle 25B [synthe... 109 1e-22 emb|CAE45909.2| hypothetical protein [Homo sapiens] 109 1e-22 pdb|1CWR|A Chain A, Human Cdc25b Catalytic Domain Without I... 109 1e-22 dbj|BAB46915.1| hypothetical protein [Macaca fascicularis] 109 1e-22 ... ref|XP_456705.1| unnamed protein product [Debaryomyces hans... 94 8e-18 ref|XP_446231.1| unnamed protein product [Candida glabrata]... 93 1e-17 emb|CAA45885.1| NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi|422216... 92 3e-17

10. „CDC25“, Arabidopsis Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value pdb|1T3K|A Chain A, Nmr Structure Of A Cdc25-Like Dual-Spec... 273 7e-73 gb|AAO39886.1| At5g03455 [Arabidopsis thaliana] >gi|2645085... 271 3e-72 emb|CAB83305.1| putative protein [Arabidopsis thaliana] >gi... 271 3e-72 gb|AAM63780.1| unknown [Arabidopsis thaliana] 268 3e-71 ref|NP_912542.1| Hypothetical protein [Oryza sativa (japoni... 175 2e-43 gb|AAU11500.1| rhodanese-like protein [Holcus lanatus] 170 8e-42 ref|NP_922597.1| unknown protein [Oryza sativa (japonica cu... 169 2e-41 gb|EAA75237.1| hypothetical protein FG05666.1 [Gibberella z... 70 1e-11 gb|EAA53924.1| hypothetical protein MG01909.4 [Magnaporthe ... 68 7e-11 ref|XP_502979.1| hypothetical protein [Yarrowia lipolytica]... 67 1e-10 gb|EAA58015.1| hypothetical protein AN6040.2 [Aspergillus n... 66 2e-10 ref|XP_327252.1| predicted protein [Neurospora crassa] >gi|... 62 3e-09 ref|XP_462481.1| unnamed protein product [Debaryomyces hans... 56 3e-07 gb|EAL22654.1| hypothetical protein CNBB1040 [Cryptococcus ... 53 2e-06 gb|EAK93619.1| possible protein phosphatase [Candida albica... 52 4e-06 ref|NP_595247.1| rhodanase domain protein [Schizosaccharomy... 51 9e-06 ref|NP_869856.1| hypothetical protein RB11227 [Rhodopirellu... 46 2e-04 gb|EAA42885.1| GLP_574_157368_157730 [Giardia lamblia ATCC ... 46 3e-04 ref|YP_144680.1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo... 45 4e-04 ref|ZP_00282577.1| COG0607: Rhodanese-related sulfurtransfe... 44 9e-04 sp|P27477|THTR_SYNP7 Putative thiosulfate sulfurtransferase... 44 0.001 gb|EAK87236.1| hypothetical protein UM06379.1 [Ustilago may... 44 0.001 gb|AAP10445.1| Hydroxyacylglutathione hydrolase [Bacillus c... 43 0.003 ref|NP_015526.1| Arr2p [Saccharomyces cerevisiae] >gi|45269... 42 0.003 ref|YP_005018.1| putative sulfurtransferase [Thermus thermo... 42 0.003 ref|XP_448265.1| unnamed protein product [Candida glabrata]... 42 0.003 emb|CAA45885.1| NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi|422216... 42 0.006 (chybí regulační doména?) Landrieu et al. 2004

11. Y15 T14 Y15 Y15 T161 T14 T14 T161 T161 Y15 Y15 T14 T14 T161 T161 A to ještě není všechno: CDK mají i další fosforylační místa. cdc25 wee1 cyklin

12. CAKs – CDK activating kinases Kvasinky: • S. pombe: • Mcs6/Mcs2 (CDK/cyklin) je CAK i CTD kin. • upstream CAKAK (monomerní) • S. cerevisiae: • monomerní CAK (Cak1p) • monomerní CTD kin (Kin28p)

13. A co rostliny? • Arabidopsis: • CAK1-CAK4 • CAK2, CAK4 blízké CDK7 • substrátem CTD i CDK • CAK1 (CDKF): upstream od CAK2,4 (CAKAK!), komplementuje cak1ts Shimotohno et al. (incl. K. Bišová) 2004

14. CAK mezi rost. CDK Robbens et al. 2004

15. ... a u živočichů exocytosis via NSF (PCTAIRE! – Liu et al. 2006) (Doerner lab 2005)

16. Rozdíly jsou v délce kinázové kaskády? S. pombe, metazoa, rostliny S. cerevisiae CAKAK CTD CAK inaktivní aktivní kináza substrát CDK

17. Degradace proteinů jakožto „extrémní modifikace“

18. Zpět k cyklovým hodinám kvasinek

19. Rekapitulace: transkripční regulační obvody pučivé kvasinky Swi4, Swi6 Mbp1, Swi6 Co brání současné aktivaci CLB a CLN? Amon et al. 1993

20. Mutanti S.c. s dlouhými pupeny a G1 jádrem cdc4, cdc34, cdc53

21. ... a také všeobecný nedostatek CLB! (drženo na živu GAL:CLB5) (Schwob et al. 1994)

22. Clb/Cdc28 potřebuje k aktivaci ještě něco ...

23. ... co chybí v „dlouhopupenatých“ mutantech. (pozor na kontroly!!)

24. p40SIC1: inhibitor CDK • nalezen biochemicky • esenciální • ale dvojitý mutant cdc34 sic1 replikuje v pm- • je cdc34, cdc4, cdc53 třeba pro degradaci?? ANO! • inhibitory CDK • degradace

25. Model

26. Sic1 sám je regulován i transkripčně Jorgensen and Tyers 2000

27. Inhibitory CDK (CKI): CLB p21, p27Kip1 Cdc28 p40Sic1 CycA etc. CDK2/4 CycD p15 CDK4 CDK4

28. CKI a vstup do cyklu (živ. b.) p53 TGF b p21 p15 p27 p16 CycD/CDK4 CycE/CDK2 pRB G0/G1 S

29. CDK inhibitory jakožto antionkogeny

30. Co jsou Cdc4, Cdc34, Cdc53??Degradace proteinů zprostředkovaná ubikvitinací

31. Ubiquitin 76 aa, 8.5 kDa 96 % ident. člověk-kvasinka

32. CDC34 = E2!!!

33. E3 – ubikvitin ligázy: SCF (Skp1/cullin/F-box) Sic1 Cdc34 Cdc4 NEDD8= Rub1 (related to ubiquitin) Cul1 = cullin = Cdc53!!

34. Jiné tváře SCF Sic1 Cdc34 Cdc4 TIR1 Neddylace: AXR1 deNeddylace: COP9 signalosom auxin response fotomorfogeneze Cul1 = cullin = Cdc53!!, CUL1

35. ... degradace cyklinů ...

36. Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy (G2/M)? • Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, CycA/B),tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny? • Aktivace CDK fosforylací T161 • Dereprese CDK defosforylací T14, Y15 • Ještě něco??

37. Jakou roli hraje degradace mitotických cyklinů? • Nedegradovatelný cyklin A,B • Nadprodukce „destruction boxu“ Metaphase arrest!! Je destrukce cyklinu nutná pro přechod Meta/Ana? RxxLxxxxN cyclin „destruction box“

38. cyclin CDK CDK metafáze anafáze telofáze G1

39. ALE: cdc15! lND fenotyp Anafáze při vysoké hladině CLB/CDK!! (Surana et al. 1993)

40. ... a nadbytek CLB blokuje v anafázi, ne metafázi! (Surana et al. 1993)

41. cyclin Cdc15 CDK CDK metafáze anafáze telofáze G1 ... ALE předcházející pokusy s M blokem po inhibici degradace cyklinů!

42. Jak smířit modely? cyclin X Cdc15 CDK CDK metafáze anafáze telofáze G1 ... a co tedy degraduje ty cykliny??

43. CLB se nehromadí v buňkách bez CLN (Amon et al. 1994)

44. ... a příčinou je specifická degradace!

45. ... a navíc: • Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB. • Model!

46. Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor? (CKI) none CLN CLB