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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY

Identification of Novel Genes Involved in Long-Chain n-Alkane Degradation by Acinetobacter sp. Strain DSM 17874. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY May 2007. 长链烷烃 , 主链长度大于 20 个碳原子，是在原油的处理，运输等过程中主要的环境污染物。

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Presentation Transcript

  1. Identification of Novel Genes Involved in Long-Chain n-Alkane Degradation by Acinetobacter sp. Strain DSM 17874 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY May 2007

  2. 长链烷烃, 主链长度大于20个碳原子，是在原油的处理，运输等过程中主要的环境污染物。 已经鉴定出一些细菌产生的酶能在有氧条件下降解烷烃，如：细胞色素P450，单氧化酶，双氧化酶等等。

  3. 在烷烃的降解过程中最为突出的是Pseudomonas putida GPo1 (ATCC2934）中的Alk 系统。该系统能将烷烃经β-氧化途径降解为相对应的醇、醛、羧酸和乙酰辅酶A。 多数已知的降解烷烃的系统主要以降解短链烷烃为主。仅一少部分已知的酶与降解长链烷烃相关。 不动杆菌属（Acinetobacter）的细菌, 能利用主链长度从10到44个碳原子的烷烃。其中A.sp. strain DSM 17874 能以C10到C40的长链烷烃为唯一碳原生长。

  4. 从Acinetobacter中鉴定了两个与alkB旁系同源的基因，alkMa 和alkMb, 这两个基因均表现为涉及降解主链碳原子数为20的长链烷烃。 almA,与降解32碳甚至更长的长链烷烃相关。

  5. 实验中所用到的菌株、质粒、启动子

  6. 构建A.sp.DSM 17874 转座突变文库 • pLOFKm质粒：带有min-Tn10 转位子、卡那霉素抗性标记, 结合载体的起始区oriT，Tn10 转位子带有IPTG诱导的启动子。该质粒在A.sp.DSM 17874 中不能复制，主要用于构建转座突变文库。 • 将带有pLOFKm质粒的Escherichia coli S17-1 (pir)/pLOFKm和A.sp.DSM 17874 在抗性选择压力下共同培养并用IPTG诱导转座酶的产生，使pLOFKm质粒转入A.sp.DSM 17874 中。 • 构建的A.sp. DSM 17874 转座突变文库包含有近 6,800种 A.sp. DSM 17874 转座突变子。

  7. 高通量筛选 A.sp. DSM 17874 转座突变文库中不能降解长链烷烃的突变子 • 在各突变株中加入C32 烷烃，以碘硝基四唑紫 (INT)侦测各突变株的生长情况（ INT的减少与细胞呼吸强度成正比）。筛选突变株中不能利用 C32 烷烃的突变子。 • 为了进一步确认筛选的结果，当将筛选到的突变子加入到以醋酸钠或C16烷烃为唯一碳原的培养基中，各突变子均表现为野生型水平的生长速率。 • 经筛选得到34个突变子，并鉴定了16个假定与降解长链烷烃相关的基因。

  8. almA基因在其它能降解长链烷烃的Acinetobacter属的菌中的定位almA基因在其它能降解长链烷烃的Acinetobacter属的菌中的定位 • 根据在A.sp. DSM 17874突变菌基因组中与转座子相接的区域，以almA1和almA2为引物进行反向PCR 扩增得到Acinetobacter属中A.sp. strain M-1和A.sp. strain RAG-1的almA 同源基因。 • 而Acinetobacter baylyi ADP1 ACIAD3192 的基因序列直接从GenBank中获得。

  9. A.sp DSM 17874 almA 编码区与A. baylyi ADP1的 ACIAD3192 表现出74.8% 的序列同源性。而在基因产物AlmA和 ACIAD3192中，同源性为 76.7%。 • 在A.sp. strain DSM 17874 和A.sp. strain RAG-1 中的almA 和 orf1 核算序列完全相同。 • A.sp. strain DSM 17874 和 A.sp. strain M-1 在核算序列上almA有85.7% 的同源性，orf1则有75.5% 。 almA 在Acinetobacter 属的不同菌中的区域

  10. 构建A.sp.DSM 17874 的almA 和 orf1 的缺失突变菌株MAV1 和 BKO2 • 构建自杀性质粒 pLAL50和pBKO2 • 以A.sp. DSM 17874的DNA为模版，almA3和almA4为引物扩增almA ；orf1:1和orf1:2为引物扩增orf1，将almA扩增产物酶切，取约3kb的片断连接到pSOK804上；将orf1扩增产物酶切，将酶切的约3kb的片断连接到pSOK201上。 • 自杀性质粒 pLAL50和pBKO2先以热转型法转入E. coli S17-1 (pir)中，随后通过菌体间的接合作用转入A.sp DSM 17874 中。以Southern印记法检测almA 和 orf1被消除的情况。

  11. almA 基因在降解长链烷烃中的效应 A.sp. DSM 17874 (野生型; ○) A.sp. strain MAV1 (almA消除突变; ▽) C20 C24

  12. C32 C36

  13. orf1基因的效应 • 在突变株BKO2中研究orf1 是否在长链烷烃代谢中起作用的过程中，发现在以C20、C24、C32、和C36为唯一碳原的条件下生长情况与野生型相似。 • 这一结果表明，orf1 与长链烷烃的代谢并没有多大关系。

  14. 构建 pALMA1 和 pACIAD1 质粒，用作回复突变的研究 • 以A.sp. DSM 17874的DNA为模版，almA5和almA6为引物扩增almA ，将almA扩增产物酶切并连接到pDLM02.1载体上，构建pALMA1质粒。 • 以A. baylyi ADP1 的ACIAD3192 为模版，ACIAD1和ACIAD2 为引物扩增，扩增产物酶切并连接到 pDLM02.1载体上，构建pACIAD1质粒。

  15. almA 回复突变的活力测定 C32 C36 A.sp. strain DSM 17874/pDLM02.1 (○) A.sp. strain MAV1/pDLM02.1 (□), A.sp. strain MAV1/pALMA1 (▽) A.sp. strain MAV1/pACIAD1 (△)

  16. That's all,thank you !

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