IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ

1. IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: bayram@gantep.edu.tr Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008

2. Amaç • Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma • Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma • Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme

3. Sunu Akışı • Giriş; • Araştırma laboratuarı • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet

4. Sunu Akışı • Giriş; • Araştırma laboratuarı • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet

5. İn Vitro Araştırma Laboratuarı • Nasıl kurulur? • Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK • Profesyonel destek • Personel; biyolog, teknisyen, asistan

10. İn vitro yöntemler nerede kullanılır? • İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi; • Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs. • Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL • Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu • İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi • Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs • Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs

11. İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır? • Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs • Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite • Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue • Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot • Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR • Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya • Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)

12. Sunu Akışı • Giriş; • Araştırma laboratuarı • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet

13. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA) (Substrat) (‘enzime bağlı secondary ab’) (‘detecting ab’) (Nümune) (‘capture ab’)

14. ELİSA

15. ImmunoSito/Histokimya Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi

16. ‘Blotting’ (leke) • Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans) • Western blot; protein antibody ile • Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile • Southwestern blot: DNA bağlı protein • Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot

17. Western Blot (Immunoblot) • Doku homojenatı/ekstraktı, hücre • Spesifik proteini, düzeyini belirlemek

18. Polymerase Chain Reaction (PCR)

19. Microarray (Mikrodizi) • DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays • Protein mikroarray • Tissue mikroarray • Transfection mikroarray (hücre microarray) • Kimyasal bileşik mikroarray • Antibody mikroarray • Gene Chip Analizleri

20. DNA Mikroarray • Gen/genom chip, DNA chip, gen array • Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu • Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı kullanırlar.

21. Genomic • Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması • Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans) • tespitine dayalı çalışmalar

22. Proteomic • ‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır • Genel olarak protein çalışmaları • (yapı ve fonksiyonları) • ‘Proteome’; ‘protein’ ve ‘genome’ dan oluşur. • Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler

23. Small Interfering RNA (siRNA) • ‘short interfering RNA’veya‘silencing RNA’ • Spesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda • çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur. • siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek • Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down) • kullanılabilir

24. Flow Cytometry • DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs) • Apopitozis çalışmalarında • Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları) • Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs) • Kromozom analiz ve tespitinde • RNA çalışmalarında • Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda

25. http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/ support/training/online/ITF/index.shtml

26. Akım Sitometri (Flow Cytometry) • Tek dalga ışın demeti(lazer) • sıvı akımına yönlendirilir • Çevredeki detektörler ışığın • kırılma yönü, yaydığı • floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır

27. Hücre Siklüs Ölçümü

28. Sunu Akışı • Giriş; • Araştırma laboratuarı • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet

29. Hücre Kültürleri • İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları • Uygun çalışma modeli • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2-agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

30. Hücre Dizileri (‘Cell line’) • Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40); • BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri) • 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri) • Kanserleşmiş hücreler kullanılır • A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri) NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection

31. DMEM,%10 FCS, 2mM L-glutamine • Tek katman (‘monolayer’) oluşturur A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri) (Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)

32. Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4m)

33. Hücre Canlılığı - MTT 50 100 200 400 SF FCS %10 5 10 Dizel Egzoz Partikülleri (g/ml)

34. 24 saat DEP’nin A549hücre canlılığı üzerine etkisi ***p<0.0001-0g/ml DEP 72saat 48saat

35. DEP (10-1000g/ml) ile 72s İnkübasyonun A549’dan Sitokin Salınımına Etkisi

36. DEP (10g/ml)’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi SF Bayram H et al, Eur Respir J 2006

37. DEP (10g/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi SF *P<0.05 and **P<0.005 vs SF Bayram H et al, Eur Respir J 2006

38. DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi DEP (g/ml) 10% FCS 0 1 10 p21CIP1/WAF1 -actin * ** *P<0.05 and **P<0.01 vs 0g/ml DEP 10% FCS

39. DEP (10g/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi *P<0.05vs SF

40. Sunu Akışı • Giriş; • Araştırma laboratuarı • Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet

41. Primer Hücreler-Avantajlar • İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler

42. Primer Hücre Kültürü-Dezavantajlar • Elde edilmeleri daha zor • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar • Etik sorunlar

43. Doku - Hücre Kaynağı • Cerrahi eksplant • Pnömonektomi, Lobektomi • Transplant akciğeri • Biyopsi • Fırçalama (epitel hücreler) • Enzimatik digestion, • Disseksiyon • Hazır, ticari olarak

44. Akciğerin Primer Hücre Kültürleri • Düz kas hücreleri • Fibroblast kültürleri • Alveolar epitel hücreleri • Bronş epitel hücreleri

45. Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri • Fırçalama, • Enzimatik digestion, • Disseksiyon

46. Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

47. Kültür Vasatı • ‘Medium 199’ • Foetal bovine serum (2.5ml) • 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml) • 1ml human transferrin (2.5 g/ml) • 1ml epidermal growth factor (20g/ml) • 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml) • 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) • 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon • 100ml tamamlanır ve 0.2m por çap filtreden geçirilir

48. Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı

49. 24-Kuyucuklu Plate

50. 1. Hafta 3. Hafta (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)