5.44k likes | 6.61k Views
Descriere tehnici cromatografice
E N D
În 1906 Tswett a publicat un articol, în revista de specialitate Berichte der deutschen botanischen Gesellschaft în separarea unor pigmenţi vegetali pe un tub îngust de sticlă, umplut cu carbonat de calciu. Pigmenţii de diferite culori au fost astfel separaţi de pe carbonat prin eluţie cu eter de petrol. care descrie Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)
Istoric • Plinius cel Bătrân (23-79 după Cristos) în Historia Naturalis, egiptean (ca. 500 înainte de Cristos) de separare a unor pigmenţi prin depunerea soluţiei lor pe un precum papirusul. Această tehnică poate fi considerată a fi cromatografia pe hârtie. descrie un proces material celulozic, foarte aproape de
În 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hârtie şi include ilustraţii ale cromatogramelor în lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe. Richard Kuhn şi Edgar Lederer (1931, separarea a două componente din carotenul cristalizat, privit până în acel moment drept un singur compus chimic, prin cromatografie de adsorbţie. Martin şi Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiţie) Consden, Gordon, şi Martin (descrierea cromatografiei pe hârtie). 1950 dezvoltarea cromatografiei gaz-lichide (GLC), prin care se separă compuşi gazoşi sau volatili pe o coloană îngustă umplută cu un adsorbent. Cromatografia în strat subţire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se separă compuşi prin trecerea unui solvent printr-un strat subţire de o grosime submilimetrică, întins pe un suport precum placa de sticlă a fost dezvoltată în anii „60. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă chromatography, HPLC), tehnică care se separă compuşi prin introducerea probei într-o coloană îngustă încărcată cu adsorbent şi forţarea eluţiei sale prin presiune a fost dezvoltată în deceniul al şaptelea. Cromatografia pe hârtie şi mai ales cea în strat subţire sunt încă utilizate, fiind deseori preferate cromatografiei gaz-lichid şi cromatografiei lichide de înaltă performanţă din cauza marii lor puteri în separarea efectivă, cu echipamente ieftine şi costuri scăzute. • • • • • • (high performance liquid • •
Principala aplicaţie a cromatografiei este cea de separare a unor amestecuri de compuşi în scopuri analitice sau preparative. Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la identificarea, izolarea, purificarea şi cuantificarea unor compuşi individual separaţi. În plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate în determinarea omogenităţii unor substanţe chimice, determinarea structurii moleculare, determinarea produşilor de reacţie şi a proceselor care le însoţesc. Cromatografia cuprinde un grup important şi diversificat de metode care permit cercetătorului separarea unor componenţi foarte apropiaţi (înrudiţi) dintr-un amestec complex de substanţe (de componente), multe dintre aceste separări nefiind posibile prin alte tehnici. În toate separările cromatografice proba este transportată într-o fază mobilă, care poate fi un gaz, un lichid sau un fluid în stare supercritică. Aceasta fază mobilă este forţată să traverseze o fază nemiscibilă, fază staţionară, care se găseşte într-o coloană sau pe o suprafaţă solidă. Cele două faze sunt alese în aşa fel încât proba să se distribuie între faza mobilă şi cea staţionară în proporţii diferite. Componentele care sunt mai puternic reţinute de către faza staţionară se vor mişca şi vor curge mai lent cu faza mobilă. Din contră, componentele uşor legate de către faza staţionară vor traversa această fază mai rapid. Drept consecinţă a acestor diferenţe în mobilitate, componentele probei se vor separa în benzi ori zone discrete, care pot fi analizate calitativ şi/sau cantitativ. Termenul de migrare utilizat în cromatografie reprezintă o descriere generică a mişcării moleculelor în cromatografie şi el nu trebuie confundat cu migrarea unei specii ionice sub acţiunea unui câmp electric. • • • • • •
Clasificarea metodelor de cromatografie pe coloană • Metodele cromatografice pot fi clasificate ţinând cont de două criterii. – Prima clasificare este bazată pe metoda fizică prin care fazele mobilă şi staţionară vin în contact. • Astfel, în cromatografia pe coloană, faza staţionară este reţinută într-un tub îngust, prin care faza mobilă este forţată să treacă. • În cromatografia planară, faza staţionară este depusă pe un suport, în interstiţiile unui material poros (de tipul hârtiei de filtru, ca exemplu). În acest caz, faza mobilă se mişcă prin faza staţionară datorită forţei capilare, sub influenţa forţei gravitaţionale. Se poate remarca că echilibrele care apar în cazul celor două tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate, teoriile dezvoltate în cazul uneia dintre cele două metode putând fi formalizate asemănător şi uşor adaptate la cealaltă tehnică cromatografică.
O clasificare mult mai fundamentată a metodelor cromatografice se bazează pe tipul fazelor mobile şi staţionare şi tipul de echilibru stabilit în transferul soluturilor între cele două faze.
ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUŢIE PE COLOANĂ Prezentarea schematică a modului prin substanţe, notate A şi B sunt separate cromatografie de eluţie pe o coloană, cu fază mobilă lichidă. Eluţia spălarea, trecerea speciilor (substanţelor A şi B, în speţă) prin adăugarea continuă solvent (fază proaspăt (a). o porţiune unică introdusă la capătul superior al coloanei (timpul to), după care componentele probei se distribuie independent, între cele două faze. (b) Semnalul înregistrat de către un detector în funcţie de evoluţia eluţiei prin coloana prezentată în (a). • care două prin implică la de coloană, mobilă) de este probă
Introducerea unui volum adiţional de fază mobilă (de eluent) forţează volumul de solvent care conţine o parte a probei să coboare prin coloană, unde, se stabileşte o nouă partiţie între faza mobilă şi cea staţionară (timpul t1). Simultan stabileşte un nou echilibru și o nouă partiţie între solventul proaspăt (faza mobilă nou adăugată) şi faza staţionară la locul iniţial de adăugare a probei. Adăugarea unor noi volume de solvent va avea ca efect coborârea moleculelor de solut spre capătul de jos al coloanei printr-o serie continuă de transferuri între faza mobilă şi cea staţionară. Cum mişcarea solutului se poate realiza numai prin intermediul fazei mobile, viteza medie cu care zona (banda) solutului migrează în josul coloanei depinde de fracţia de timp în care solutul este reţinut de către această fază. Această fracţie este mică pentru componenta mai puternic reţinută de către faza staţionară (compusul B, din figură) şi este mare în cazul în care retenţia în faza mobilă este mai adecvată (componenta A). În mod ideal, diferenţele rezultate în vitezele diferite conduc la separarea componentelor dintr-un amestec în benzi sau zone localizate de-a lungul coloanei (timpul t3din figură). Izolarea şi deci separarea speciilor A şi B este urmarea trecerii unei cantităţi suficiente de fază mobilă prin coloană şi care conduce la o separare individuală de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate (timpii t3şi t4din figură). cu aceasta se
DILUŢIA ANALITULUI ilustrează o caracteristică importantă a procesului de separare, denumită diluţia analitului fenomen care însoţeşte aproape întotdeauna separările cromatografice. Astfel, mărimea zonei originale care conţine analiţii din figură este notabil mai mică decât cele două zone care conţin componentele A şi B şi care ajung în zona detectorului. Acest fenomen semnificativ de diluare se manifestă odată cu componentelor şi din această cauză, detectorii utilizaţi pentru separarea analiţilor trebuie adesea să prezinte o sensibilitate mai mare decât cea care ar fi dorită dacă procesul de separare nu ar fi necesar. • Figura separarea
CROMATOGRAMELE un detector care la o • Dacă modificare de concentraţie a solutului este plasat la capătul terminal al coloanei iar semnalul său este funcţie de timp (sau de volumul de fază mobilă adăugat) se obţin o serie de peak-uri, prezentate în figură reprezentări grafice cromatograme, care sunt utilizate atât în cromatografia analitică preparativă. Poziţia timpului poate servi componentelor din probă, aria fiecăruia conducând la determinarea cantitativă a fiecărui component. răspunde reprezentat grafic în (b). Asemenea numele de poartă cât în pe cea axa şi peak-urilor la identificarea
EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE ŞI A LĂŢIMII ZONEI ASUPRA REZOLUŢIEI CROMATOGRAFICE Figura profilurile soluţilor A şi B la două etape diferite de eluţie: o etapă timpurie (momentul t1) şi o etapă spre final (momentul t2). • alăturată prezintă concentraţiilor Se poate spune ca specia B este mai puternic reţinută şi din această cauză componentul B întârzie mai mult pe coloană pe parcursul migrării. Această întârziere în coborâre conduce la creşterea distanţei dintre cele două zone. La acelaşi interval de timp, are loc aceeaşi lărgire a zonelor celor două componente, fenomen ce scade eficienţa coloanei cromatografice. Cum lărgirea zonei este inevitabilă, se pot alege condiţiile în aşa fel ca acest fenomen să se manifeste cât mai lent odată cu separarea benzilor. Astfel, o separare completă şi de aici o rezoluţie bună, se realizează adesea în condiţiile în care lungimea coloanei este suficient de mare.
două metode de îmbunătăţire a separării în cazul unui amestec ipotetic de două componente (figură, panel a). În condiţiile au fost modificate astfel încât primul component se deplasează mai repede în josul coloanei cu viteză mai mare în timp ce al doilea se deplasează mai încet. figura (b) • alăturată (c) : vitezele de împrăştiere a celor două zone au fost micşorate. Ambele metode conduc la o separare mai distinctă a celor două componente (a) cromatograma originală cu cele două peak-uri îmbunătăţirea separării creşterea separării cromatografice şi (c) prin scăderea împrăştierii benzii cromatografice. suprapuse; prin benzilor Ambele metode conduc la o separare mai distinctă a celor două componente (b)
Viteza de migrare a soluţÌlor • Eficienţa unei coloane cromatografice în separarea a doi soluţi depinde, în parte, de vitezele relative cu care cei doi compuşi sunt eluaţi. Aceste viteze sunt determinate de constantelor de echilibru ale procesului prin care soluţii se distribuie independent între faza mobilă şi cea staţionară. magnitudinea
CONSTANTELE DE DISTRIBUŢIE Adeseori, echilibrele de distribuţie implicate în cromatografie sunt descrise prin ecuaţii care implică transferul unui analit între fazele mobilă şi staţionară. Astfel, pentru speciile A de solut se poate scrie următorul echilibru al procesului de adsorbţie-desorbţie: Constanta de echilibru, K, pentru această reacţie este numită constantă de distribuţie, raport de partiţie sau coeficient de partiţie Comisia de Nomenclatură Analitică a IUPAC pentru cromatografie recomandă utilizarea termenului de constantă de distribuţie, Kcîn loc de vechiul termen în loc de vechiul termen de coeficient de partiţie sau raport de partiţie, K. Totuși, în literatura de specialitate ambii termeni sunt încă utilizaţi. Constanta K este definită conform formulei: CSreprezintă concentraţia molară a solutului din faza staţionară iar CMeste concentraţia molară din faza mobilă; în mod ideal, K este constantă în tot domeniul de concentraţii a solutului, iar CSeste proporţională cu CM. Tipul de cromatografie în care se aplică ecuaţia poartă denumirea de cromatografie lineară iar rezultanta ei este caracterizată printr-o simetrie de tip Gauss a peak-urilor şi a timpilor de retenţie, parametrii care sunt independenţi de cantitatea de analit supusă analizei. În general, studiile teoretice se limitează la o astfel de cromatografie lineară.
TIMPUL DE RETENŢIE Figura alăturată reprezintă generic o cromatogramă pentru o probă ce conţine un singur analit. Timpul necesar probei de a parcurge distanţa momentul inoculării până la detecţia semnalului detector este numit timp de retenţie, fiind simbolizat prin tR. Peak-ul prezentat în partea din stânga cromatogramei este dat de speciile care nu sunt reţinute de către Adesea, proba sau faza mobilă conţine specii ce nu sunt reţinute pe parcursul migrării pe coloană. Astfel de specii interacţionează staţionară sunt de real folos în identificarea peak-ului analitului de interes. dintre de său coloană. care nu cu faza
Peak-ul mic din stânga reprezintă o specie care nu este reţinută pe coloană şi a cărei semnal apare la detector aproape imediat după ce eluţia a fost începută. Astfel, timpul său de eluţie (tM) este aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile să treacă prin coloană. Timpul necesar speciilor nereţinute să ajungă la detector se notează cu tMşi se numeşte timp mort. Viteza de migrare a speciilor nereţinute este în acelaşi domeniu cu viteza de mişcare a moleculelor fazei mobile.
• Viteza lineară medie de migrare a solutului (ν ) este dată de relaţia: • unde împachetate. L este lungimea coloanei În mod similar, viteza medie lineară de mişcare a unei molecule de fază mobilă (u) este dată de relaţia: unde tM reprezintă timpul mort, timpul necesar pentru ca o moleculă medie de fază mobilă să treacă prin coloană.
De exemplu, dacă o coloană are un volum total de 100 ml iar faza staţionară ocupă 40 ml, rezultă că faza mobilă ocupă un volum de 60 ml. Dacă faza mobilă curge cu o viteză de 5 ml/min, se poate calcula că sunt necesare 12 minute pentru ca faza mobilă să traverseze coloana, de la injector la detectorul situat la capătul terminal al coloanei. Uneori, tMpoate fi determinat prin identificarea unui mic peak la începutul cromatogramei, rezultat dintr-o uşoară diferenţă dată de solventul care provine din faza mobilă ce conţine proba adăugată. De asemenea tMpoate fi determinat prin măsurarea timpului de eluţie a unei probe care nu este reţinută absolut de loc de către faza staţionară. În cazul unei răşini schimbătoare de ioni cationice, pentru a se determina tM, se poate utiliza o proteină cu sarcină negativă. • • •
• Se notabil de arătat că există şi alţi factori precum lungimea şi conectează injectorul şi detectorul la coloană care pot afecta valorile tM. • Practic, considerând o coloană împachetată de 25 cm lungime, cu un diametru interior de 1 cm, volumul total al coloanei este de 19,6 ml (V= •r2 •L = 3,14 •0,52 •25cm). Dacă faza mobilă ocupă 60% din volumul spaţiului gol, care defineşte «timpul mort» este egal cu 11,8 ml. El reprezintă volumul spaţiului gol, denumit „void volume” = V0 diametrul tubului care coloanei, volumul
RELAŢIA DINTRE TIMPUL DE RETENŢIE ŞI CONSTANTA DE DISTRIBUŢIE În scopul prezentării relaţiei dintre timpul de retenţie al solutului şi constanta sa de distribuţie, se poate exprima viteza de migrare drept o fracţie a vitezei fazei mobile: Această fracţie este egală cu numărul mediu de moli de solut din faza mobilă, la un moment dat, raportat la numărul de moli totali de solut din coloană, conform următoarei relaţii:
Numărul total de moli de solut din faza mobilă este egal cu concentraţia molară a solutului din faza mobilă, cM, multiplicată cu volumul acestei faze, VM. În mod similar, numărul de moli de solut din faza staţionară este dat de produsul concentraţiei cSde solut din faza staţionară, multiplicat cu volumul său din aceeaşi fază, VS. Astfel se poate scrie:
Prin substituirea ecuaţiei constantei de distribuție în această ecuaţie se obţine viteza de migrare a solutului ca funcţie de constanta de distribuţie şi ca funcţie de volumele fazelor staţionare şi mobile: Cele două volume pot fi estimate prin metode specifice fiecărui tip de cromatografie.
VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENŢIE Factorul de retenţie, sau factorul de capacitate reprezintă un parametru important care este general utilizat în descrierea vitezelor de migrare a soluturilor pe coloană. Pentru un solut A, factorul de retenţie k’Aeste definit ca: unde KAreprezintă constanta de distribuţie a speciei A. Comisia IUPAC de Nomenclatură Analitică recomandă denumirea de factor de retenţie k', însă denumirea de factor de capacitate este încă utilizat în literatura de specialitate. Prin substituţia ecuaţiei 5 în ecuaţia 4 rezultă:
În scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina k’A cromatogramă, se vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6, dintr-o L M =L u = (3) (2) t tR ceea ce conduce la:
rearanjarea acestei ecuaţii După cum se observă în figură, tRşi sunt uşor de cromatogramă. În condiţiile unui factor de retenţie pentru un solut mult mai mic decât unitatea, eluţia se realizează mai rapid şi din această este dificil a se determina timpii de retenţie cu acurateţe. În condiţiile în care factorul de retenţie este de ordinul zecilor (de exemplu 20 sau 30), timpii de eluţie devin anormal de mari. Ideal, separarea se efectuează în condiţiile unor factori de retenţie cuprinşi între 2 şi 10. tM dintr-o obţinut
VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE SELECTIVITATE Factorul de selectivitate al unei coloane () pentru două specii, A şi B este definit prin formula: (9) unde KBreprezintă constanta de distribuţie a speciei B, mai puternic reţinută pe coloană, în timp constanta de distribuţie a speciei A, mai puţin reţinută pe coloană, şi mai rapid eluată de pe aceasta. Prin definiţie, este întotdeauna mai mare decât unitatea. ce KA reprezintă
Prin substituirea ecuaţiei 5 şi a ecuaţiei analoage solutul B în obţine, după relaţia de legătură între factorul de selectivitate pentru cei doi soluţi şi factorii lor de retenţie: • pentru 9 se ecuaţia la rearanjare, (10) unde k'Bşi k'Areprezintă factorii de retenţie ai solutului B, respectiv A. Substituţia în ecuaţia 8 pentru cei doi soluţi din ecuaţia 10 conduce la o expresie ce permite determinarea experimentală lui dintr-o cromatogramă: factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea unei coloane cromatografice
Împrăştierea zonei şi eficienţa coloanei • Teoria dinamică, sau teoria cinetică a cromatografiei explică cu succes în termeni cantitativi formele peak- urilor cromatografice şi efectele diverselor variabile implicate în lăţirea acestor detailată a acestei teorii se bazează pe mecanismul de repartiţie aleatorie, putându-se da o imagine calitativă a zonelor cromatografice şi care conduce la analiza modului de împrăştiere a zonelor în condiţiile deplasării moleculelor de solut de-a Înţelegerea acestor fenomene identificarea variabilelor eficienţei coloanei şi la reducerea împrăştierii zonelor cromatografice. peak-uri. O discuţie lungul unei coloane. rezultat creşterea au ca la ce conduc
FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE Figura 4 Figura 1 Figura 2
Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogramă sau a benzilor pe coloană (figurile de mai jos) relevă o similaritate a erorilor normale, repartiţia realizându-se după un profil Gaussian, care sunt obţinute în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de frecvenţa repartiţiei a acestora. •
În unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestând o coadă (trenă) sau un front. În primul caz, trena peak-ului care apare în dreapta cromatogramei este prelungă, în timp ce frontul acestuia este abrupt. În cel de-al doilea caz, forma cromatogramei este inversată, adică frontul este prelung în timp ce trena este extrem de scurtă. Cauza comună a apariţiei frontului sau a trenei o reprezintă existenţa unei constante de distribuţie neliniare. Frontul apare de asemenea în cazul eluării unei cantităţi mari de probă pe coloană. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite deoarece conduc la separări de proastă calitate şi la timpi de eluţie cu reproductibilitate scăzută. În abordarea teoretică se consideră ca fenomenul de front sau coadă cromatografică este absent sau minim.
• După cum se cunoaşte, curbele de erori normale pot fi raţionalizate prin asumarea faptului că incertitudinea asociată cu orice măsurătoare singulară reprezintă însumarea unui număr mult mai mare de erori mici, individuale nedetectabile şi de repartiţii întâmplătoare, fiecare dintre acesta având o probabilitate egală, pozitivă sau negativă. Cea mai comună manifestare a acestor incertitudini este reprezentată de anularea uneia de către cealaltă, ceea ce conduce la o valoare medie. Cu o mică probabilitate, însumarea poate conduce la un rezultat mai mare sau mai mic decât media. Drept consecinţă, distribuţia valorilor este simetrică, în jurul valorii medii. În mod similar, forma Gaussiană cromatografice ideale poate fi atribuită combinării aditive a mişcărilor întâmplătoare a moleculelor de solut în zona cromatografică. a unei zone
Să considerăm comportamentul unei molecule de solut, care în timpul migrării, trece prin mii de transferuri între faza staţionară şi cea mobilă. Timpul petrecut în fiecare fază de transfer este deosebit de neuniform, depinzând de câştigul accidental de energie termică din mediul înconjurător pentru a realiza un transfer reversibil, în cealaltă fază. Astfel, în unele cazuri, timpul de şedere într-o fază dată, poate fi tranzitoriu, în timp ce în alte faze perioada poate fi relativ mai lungă. Cum molecula este eluată numai în timpul şederii sale în faza mobilă, are ca rezultat, migrarea sa total neuniformă în josul coloanei. Din cauza timpilor variabili de şedere, viteza medie cu care moleculele individuale se mişcă relativ în faza mobilă variază în mod considerabil. Anumite particule individuale traversează mai rapid în virtutea includerii lor accidentale în faza mobilă, majoritatea timpului de eluţie. Altele, din contră, pot prezenta întârzieri datorită includerii lor în faza staţionară, timp mai îndelungat decât timpul mediu de eluţie. Consecinţa acestor procese aleatoare este o împrăştiere simetrică a vitezelor în jurul valorii medii, iar acesta reprezintă comportamentul mediu al moleculei. Lăţimea benzii componentului separat creşte odată cu coborârea lui de- a lungul coloanei, datorită faptului că o creştere a timpului de eluţie permite manifestarea unei mai mari împrăştieri. Astfel, lăţimea zonei este în relaţie directă cu timpul de şedere în coloană şi în relaţie inversă cu viteza de curgere a fazei mobile.
METODE DE DESCRIERE A EFICIENŢEI COLOANEI În măsurarea cantitativă a eficienţei unei cromatografice în general sunt utilizaţi doi termeni înrudiţi: (1) înălţimea talerului teoretic, H şi (2) numărul de talere teoretice, parametrii prin ecuaţia: N = L/H (1.12) coloane L, lungimea coloanei împachetate (dată de obicei în centimetrii) Eficienţa coloanelor cromatografice creşte cu numărul de talere teoretice: cu cât numărul de talere teoretice este mai mare şi înălţimea talerului teoretic devine mai mică. Sunt întâlnite diferenţe enorme în eficienţa unei coloane, datorită diferenţelor dintre tipul de coloană şi fazele mobilă, respectiv staţionară, curent, eficienţa unei coloane în termen de număr de talere teoretice, poate varia între câteva sute până la mii, iar domeniul înălţimii talerelor variind între zecimi până la miimi de centimetrii sau mai mici. N. sunt asociaţi Cei doi utilizate. În mod
• Introducerea termenilor de înălţime a talerului şi a numărului de talere este datorată studiilor teoretice ale lui Martin şi Synge care au tratat coloana cromatografică similar coloanei de distilare, unde au loc o multitudine de procese discrete dar continue, în straturi înguste, denumite talere teoretice. S-a considerat că la nivelul fiecărui taler, are loc un echilibru între faza mobilă şi cea staţionară. Mişcarea solutului în josul coloanei a fost apoi tratată ca o treaptă de transfer între faza mobilă în echilibru şi următorul taler situat mai jos. Teoria talerului teoretic a fost aplicată cu succes la forma Gaussiană a peak-urilor cromatografice şi la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice. Ea a fost în final abandonată totuşi, deoarece nu a reuşit sa răspundă la explicarea modului de împrăştiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizaţi la descrierea eficienţei unei coloane au fost păstraţi în teoria vitezei de migrare. Această nomenclatură este uneori neadecvată din cauza tendinţei de a perpetua mitul prezenţei unor talere în coloana cromatografică, la nivelul cărora se realizează echilibrul între faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizează niciodată deoarece faza mobilă este într-o permanentă şi constantă mişcare.
DEFINIŢIA ÎNALŢIMII TALERULUI După cum se cunoaşte, lăţimea curbei Gaussiene este într-o relaţie directă cu varianţa 2, sau cu deviaţia standard , a unei măsurători. Cum benzile cromatografice sunt în general considerate a avea astfel de formă, este convenabil să definim eficienţa unei coloane în termen de varianţă pe unitate de lungime a coloanei. Astfel, înălţimea talerului, H, este dată de relaţia:
DEFINIŢIA ÎNĂLŢIMII TALERULUI Definiţia talerului teoretic. H = 2/ L
EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N Determinarea deviaţiei standard din peak-ul cromatografic: W = 4 .
Această definiţie a înălţimii talerului este ilustrată în figura de mai jos. După cum se observă, coloana este împachetată pe o distanţă de L centimetrii, în lungime (panelul a). Reprezentarea grafică a definiţiei talerului teoretic. H = 2/ L În partea superioară a figurii (panelul b) este reprezentată schematic, distribuţia moleculelor de-a lungul colanei cromatografice împachetate, în momentul în care analitul părăseşte coloana (acesta este din punct de vedere al timpului, timpul de retenţie, tR). Modelul curbei este Gaussian, iar localizările parametrilor L-l şi L + l sunt indicate prin linie punctată verticală.
talerului ca o situată poate fi Înălţimea gândită coloană, terminal care conţine fracţia de analit situată între L-l şi L. Cum aria, în domeniul normal de eroare a curbei este limitată de ±, fiind de aproximativ 68% din aria totală, înălţimea talerului prin definiţie conţine aproximativ 34% din analit. de porţiune la capătul De notat faptul că L este dat în centimetrii, iar varianţa, 2, este explicitată în centimetrii pătraţi; H reprezintă o distanţă exprimată în centimetrii (ecuaţia din slide-ul anterior). lineară,
Evaluarea experimentală a lui H şi N Figura alăturată reprezintă cromatogramă funcţie de timp. Varianţa peak-ului de solut poate fi obţinută printr-un procedeu grafic simplu, şi are ca unitate de măsură secunde la pătrat, fiind în mod uzual notată cu 2, pentru a o distinge de 2, care are ca unitate de măsură centimetrii pătraţi. Cele două deviaţii standard, şi sunt legate prin relaţia: o în obișnuită unde L/tRreprezintă viteza lineară medie a solutului, exprimată în centimetrii pe secundă Determinarea deviaţiei standard, , din peak-ul cromatografic: W = 4 . N = L/H (1.12)
Figura ilustrează modul simplu de aproximare al lui cromatogramă obţinută Tangentele punctelor de inflexiune de pe cele două părţi cromatografic sunt prelungite până la intersectarea lor şi se formează astfel un triunghi cu baza pe axa timpului a cromatogramei. Aria acestui triunghi reprezintă aproximativ 96% din aria totală a peak-ului. dintr-o şi experimental. ale peak-ului În evaluarea statistică, se consideră că aproximativ 96% din aria peak-ului Gaussian este inclusă în interiorul suprafeţei cu o aproximaţie de plus sau minus două deviaţii standard (±2) din valoarea sa maximă. Astfel, intercepţiile arătate în figură se manifestă la aproximativ ±2 din maximum, iar W = 4, unde W este mărimea bazei triunghiului. Substituind această relaţie în ecuaţia 1.14 şi rearanjând termenii, rezultă: Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie standard () în ecuaţia înălţimii talerului (ecuaţia 1.13 ) conduce la:
formula de calcul al numărului de talere teoretice, N: Prin substituţia formulei 1.16 în formula 1.12 urmată de rearanjarea termenilor, se obţine formula de calcul al numărului de talere teoretice, N: N = L/H (1.12) În continuare, calculat la N poate măsurarea, momente de timp, tRşi W; iar pentru a lungimea împachetate trebuie să fie de asemenea cunoscută. fi din două H, obţine coloanei
O altă metodă de aproximare a lui N, şi care este considerată de către unii practicieni mai sigură, necesită determinarea a W1/2(jumătate din lăţimea bazei peak-ului), Iar numărul de talere este dat de formula: Numărul de talere şi înălţimea talerului sunt general utilizate în literatură şi în caracterizarea unor coloane produse de către firmele de specialitate, ca măsură a performanţei acestora. Din parametrii sunt semnificativi în compararea a două coloane, este esenţial ca ei să fie determinaţi pentru acelaşi compus. cauza faptului că aceşti
VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZĂ ÎMPRĂŞTIEREA ZONEI CROMATOGRAFICE împrăştierea zonei cromatografice este consecinţa unei rate finite de procese de transfer de masă care se produc în timpul migrării solutului, de-a lungul unei coloane cromatografice. O parte dintre aceste viteze sunt controlabile, prin ajustarea unor variabile experimentale, care permit astfel creşterea calităţii separării. Tabelul prezintă parametrii cei mai importanţi care concură la rezoluţia cromatografică.
EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI MOBILE Magnitudinea efectelor cinetice asupra eficienţei coloanei depinde în mod clar de lungimea timpului în care faza mobilă este în contact cu faza staţionară, care, la rândul ei, este depinde de viteza de curgere a fazei mobile. Din această cauză, studiile referitoare la eficienţa unor coloane sunt în general axate pe determinarea lui H ca funcţie de viteza fazei mobile, u. Aceste date sunt exemplificate de cele două curbe din figura următoare, una caracterizând cromatografia de lichide, în timp ce a doua este reprezentativă cromatografiei de gaze. Ambele curbe prezintă un minim al înălţimii talerului teoretic, H (ceea ce semnifică o eficienţă maximă) la viteze mici de curgere. Această valoare minimă din cromatografia lichidă se manifestă în general la viteze de curgere care sunt asemănătoare celei de cromatografie de gaze şi deseori sunt atât de mici încât nu sunt sesizabile în condiţiile normale de operare.
Efectul vitezei de curgere a fazei mobile asupra înălţimii talerului teoretic în cazul (a) cromatografiei de lichide şi (b) gaz cromatografiei.
Teoria vitezei de împrăştiere a zonei cromatografice descrie cu acurateţe şi predicţionează forma diagramei H în funcţie de u, grafic denumit adesea diagrama van Deemter după numele descoperitorului ei. După cum se observă în figura alăturată, vitezele de curgere pentru cromatografia lichidă sunt semnificativ mai mici decât cele utilizate în cazul celei gazoase. Din această cauză, separările în gaz cromatografie sunt mai rapide decât cele de cromatografie lichidă. Mai mult, după cum arată figura, înălţimea talerului teoretic a unei coloane de cromatografie lichidă are un alt ordin de magnitudine fiind mult mai mică faţă de cel întâlnit în cazul coloanelor utilizate în cromatografia de gaze. Din această cauză, nu este practic a se utiliza coloane de cromatografie lichidă care sunt mai lungi de 25-50 cm (datorată presiunii picăturilor), în timp ce coloanele de gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi. În consecinţă, numărul total de talere şi astfel eficienţa totală a coloanei sunt în general superioare în cazul coloanelor de gaz cromatografie. În acest fel, o primă comparaţie între gaz cromatografie şi cea lichidă arată că prima metodă este capabilă de separări mai rapide şi de mai mare eficienţă.
RELAŢIA DINTRE ÎNĂLŢIMEA TALERULUI ŞI VARIABILELE COLOANEI În cursul ultimilor 40 de ani, au fost elaborate nenumărate studii teoretice şi experimentale având ca scop dezvoltarea relaţiilor cantitative care descriu efectul variabilelor prezentate în tabel, asupra înălţimii talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel elaborate o serie de expresii matematice referitoare la relaţia dintre înălţimea talerului şi parametrii variabili ai coloanei care, aplicate practic, au avut grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele nu a rezolvat în totalitate şi nu au putut să explice interacţiile fizice complexe care conduc la lăţirea zonei cromatografice. O serie dintre aceste teorii, cu toată imperfecţiunile lor au fost des utilizate şi au condus la creşterea performanţei coloanelor cromatografice. O astfel aproximare matematică a comportamentului coloanelor cromatografice este ecuaţia van Deemter, care poate fi scrisă în forma: • • H = A + B/u + Cu = A + B/u + (CS+ CM)u (1. 19)
unde H este înălţimea talerului dată în centimetrii, u este viteza lineară a fazei mobile dată în centimetrii pe secundă, în timp ce A, B, şi C sunt coeficienţi referitori la fenomenele de curgere pe multiple căi, difuzie longitudinală şi transfer de masă între faze. După cum se observă în ecuaţia 1.19, coeficientul C poate fi desfăcut în doi coeficienţi: unul (CS), în relaţie cu faza staţionară, iar celălalt, (CM), relativ la faza mobilă. Studii teoretice ulterioare au arătat că ecuaţia van Deemter este destul de exactă în explicarea eficienţei coloanei cromatografice. Ecuaţia van Deemter conţine termeni direct şi invers proporţionali precum şi termeni independenţi faţă de viteza fazei mobile. • •