EKSPERIMENTI IN VIVO NA NEANESTETISANIM ŽIVOTINJAMA

1. EKSPERIMENTI IN VIVO NA NEANESTETISANIM ŽIVOTINJAMA Dragan Obradović, Miroslav Savić

2. Tehnike istraživanja u biomedicini • Kompjuterska simulacija (in silico) • in vitrotehnike: na izolovanim makromolekulama, ćelijama i tkivima (poreklo: humano, mikroorganizmi, životinje, biljke). Daju informacije o efektima i interakcijama među molekulama, do nivoa organa • Istraživanja na životinjama • Istraživanja na ljudima i populacijama

3. U ispitivanju potencijalnog leka IN VITROTESTOVImogu da • Pokažu efekte na izolovanim ćelijama i tkivima • Ukažu na rizike od direktnih efekata • Sugerišu opravdanost daljih ispitivanja IN VITRO TESTOVI ne mogu da • Kažu da li će se željeni efekat javiti u živom organizmu • Kažu da li će se štetni efekat javiti pri primeni na živom organizmu TESTOVI NA ŽIVOTINJAMAmogu da • Sugerišu koje supstance bi, kao lekovi, mogle da budu korisne za ljude • Daju snažnu naznaku da supstanca neće biti štetna za ljude TESTOVI NA ŽIVOTINJAMAne mogu da • Predvide sa sigurnošću šta će se desiti pri primeni kod ljudi. Ipak, omogućuju da se istraživač maksimalno približi situaciji realne primene na čoveku.

4. In vitro efekti vs. in vivo profilprimer: amlodipin In vitro efekti amlodipina • Inhibicija L-tipa Ca2+ kanala u glatkim mišićima • Inhibicija K+-uzrokovanih kontrakcija u krvnim sudovima • Blokada preuzimanja Ca2+ u odgovoru na depolarizaciju • Smanjenje slobodnog Ca2+ u citosolu • Negativni inotropni efekat na srčani mišić • Inhibicija SA i AV čvora • Smanjenje srčane frekvence i brzina sprovođenja In vivo efekti amlodipina

5. Klinički vs. eksperimentalni nalaziprimer: nimodipin • Meta-analiza 22 studije sa 6468 ispitanika sa akutnim ishemijskim moždanim udarom tretiranih nimodipinom: dovoljno dokaza za pouzdano odbacivanje povoljnog terapijskog efekta (Horn i Limburg (2001) Stroke 32: 570-76). • Sistematski pregled rezultata ispitivanja u animalnom modelu: nije bilo dovoljno dokaza za otpočinjanje kliničkih ispitivanja! (Horn i sar. (2001) Stroke 32: 2433-37).

6. Izvor citiranih statističkih podataka

7. Eksperimentalne životinje • 85%pacovi, miševi i drugi glodari • 1%drugi mali sisari (kunići i dr.) • 2.7%ovce, krave, svinje i drugi veliki sisari • 0.3%psi i mačke • 0.17%majmuni • 11%ribe, amfibije, reptili i ptice

8. Broj “procedura” na životinjama

9. Svrhe procedura na životinjama

10. Distribucija procedura po organskim sistemima • U Velikoj Britaniji 2003. godine, preko 60% procedura je bilo usmereno ka određenom organskom sistemu, najviše imunskom (18%) i nervnom (15%). • Udeo procedura usmerenih ka kardiovaskularnom, respiratornom i gastrointestinalnom sistemu bio je, pojedinačno, 2-3%. • 18% procedura je bili usmereno ka više organskih sistema, a u više od 20% slučajeva podela na organske sisteme nije bila relevantna.

11. Anestezija u eksperimentu Sprovođenje procedure bez anestezije ili analgezije dozvoljeno je samo ukoliko se procenjuje da primena anestetika ili analgetika predstavlja veću traumu od same procedure, ili kada je anestezija nekompatibilna sa postizanjem cilja procedure. Više od 60% procedura u Velikoj Britaniji u 2003. godini nije koristilo anesteziju. Opšta anestezija sa oporavkom je primenjena u 19% procedura, lokalna anestezija (uglavnom u svrhu prikupljanja materijala za genetske analize) u 11%, a opšta anestezija bez oporavka u 9.5% procedura. Primena opšteg anestika kao metode žrtvovanja nije uzimana kao eksperimentalna procedura.

12. Eksperimentalni protokol • Priprema protokola: aktivnost slična pisanju manuskripta naučnog rada

13. Eksperimentalni protokol • Naslovna strana (naziv studije, istraživači, osoblje, sponzor, finansiranje) • Sadržaj • Shematski prikaz planiranih istraživanja (radni dijagram) • Uvod • Ciljevi • Eksperimentalne metode • Prikupljanje podataka i statistička analiza • Mere zaštite osoblja • Apendiksi • Bibliografija

14. Primer in vivo eksperimenta:bihejvioralna istraživanja • Bihejvior (ponašanje) predstavlja celokupnost aktivnosti individue, posebno onaj njen segment koji je podložan (spoljašnjoj) opservaciji (Bureš i sar., 1983). • Bihejvioralni testovi i modeli: osnov istraživanja u psihofarmakologiji

15. Test vs. model • “Model”: pokušaj eksperimentalnog oponašanja humane patologije koja je predmet istraživanja • “Test”: termin se primenjuje opštije, za svaku proceduru koja se koristi za karakterizaciju eksperimentalnih uticaja na ponašanje životinje

16. Animalni modeli psihijatrijskih oboljenja: validnost • “Face validity”: sličnost bihejvioralnih znakova i simptoma kod čoveka i eksperimentalne životinje • “Construct validity”: jaka korelacija između specifičnih nalaza na nivou neurona i ponašanja u animalnom modelu, u odnosu na nalaze na bolesnicima • “Predictive validity”: dobro prognoziranje terapijske efikasnosti novog tretmana

17. Uloga prekliničkih modela u razvoju psihotropnih lekova(Geyer & Markou: Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress, 2003) “Često je verovanje da animalni preklinički modeli predstavljaju usko grlo u otkrivanju psihotropnih lekova. Primena ovih modela kao “screening” tehnika se čini sporom u poređenju sa brzinom hemijske sinteze, high-throughput screening tehnikama i brzim tehnikama sekvencioniranja gena. Međutim, takvi preklinički modeli su neophodni da bi se dobila početna procena funkcionalnih efekata novih supstanci u integralnom organizmu. Jedino takve in vivo funkcionalne mere mogu da potvrde pretpostavke o mogućim efektima novih jedinjenja kod bolesnika. Pri pokušaju lečenja kompleksnih mentalnih, kognitivnih i emocionalnih smetnji koje još uvek nemaju jasno definisani neurobiološki supstrat, ili čak ni korelat, nije realističan pristup ići direktno iz test epruvete u kliniku...”

18. Bihejvioralna istraživanja 1. Zasnovana na ispitivanju neuslovljenog, ili spontanog ponašanja životinje; u osnovi ovog tipa ponašanja se nalazi biološki fenomen eksploracije – istraživanja, kao bihejvioralne aktivnosti podstaknute nepoznatom okolinom. 2. Zasnovana na uslovljenom ponašanju, kada se uspostavlja veza između percepcije određenog stimulusa (uslovna draž) i nagrade ili kazne (bezuslovna draž): bihejvioralna aktivnost je usmerena ka sticanju nagrade ili izbegavanju kazne.

19. Bihejvioralni rezultati • Najčešće: parametri motorne aktivnosti(lokomotorna aktivnost, propinjanje, njuškanje...) • Nemotorni parametri: primer ultrazvučne vokalizacije • Parametri (indeksi) ponašanja vs. dimenzije (faktori) ponašanja: statističko povezivanje (faktorska analiza) • Poistovećivanje pojedinih dimenzija ponašanja sa (pretpostavljenim) kognitivnim, emotivnim i motivacionim aspektima psihičkog statusa eksperimentalne životinje: biološko povezivanje

20. Nivoi bihejvioralnih istraživanja • Opservacija (telesna masa, temperatura, izgled krzna, aktivnost u kavezu) • Neurološki refleksi (refleks uspravljanja, treptanje, trzanje uva, orijentacija vibrisa) • Motorne funkcije (spontana aktivnost, testovi koordinacije, mišićna snaga) • Specifični aspekti ponašanja: hranjenje, učenje i pamćenje, reproduktivno ponašanje, socijalno ponašanje, testovi/modeli čiji su parametri povezani sa stanjima anksioznosti, depresije, shizofrenije, zavisnosti

21. Uzdignuti plus-lavirint: primer modela spontanog ponašanja

22. Aktivno izbegavanje: primer testa uslovljenog ponašanja

23. Pasivno izbegavanje: primer testa uslovljenog ponašanja

24. Zadatak: Na osnovu podeljenih separata radova, u zajedničkoj diskusiji, izvesti zaključke o: • Broju eksperimentalnih životinja po pojedinačnom tretmanu koji zahtevaju bihejvioralni eksperimenti • Uticaju spoljašnjih faktora, uključujući eksperimentatora, na rezultate bihejvioralnog istraživanja • Parametrima ponašanja povezanim sa stanjem ankioznosti, odnosno sa memorijskom funkcijom • Eksperimentalnim uslovima pod kojima bi praćeni parametar motorne aktivnosti najbolje odražavao spontanu lokomotornu aktivnost, odvojenu od mogućih uticaja ispitivanog tretmana na stanje anksioznosti/emocionalne rektivnosti (koristiti separat rada na narednom slajdu) • Eksperimentalnim uslovima pod kojima bi praćeni bihejvioralni parametar najbolje odražavao stanje anksioznosti, odvojeno od mogućih uticaja ispitivanog tretmana na spontanu motornu aktivnost

25. Zadatak: uslovi za selektivno praćenje spontane lokomotorne aktivnosti