Füsun FAKILI 1,2 , Bülent GÖĞEBAKAN 2 , Recep BAYRAKTAR 2 ,Serdar ÖZTUZCU 2 , Hasan BAYRAM 1,2

1. DİZEL EGZOZ PARTİKÜLLERİ VE SERUM OKSİDATİF STRESE DUYARLI HÜCRE İÇİ SİNYAL İLETİ YOLAKLARINI ETKİLEMEK SURETİYLE HAVAYOLU HÜCRE CANLILIĞINI ETKİLEMEKTEDİR Füsun FAKILI1,2, Bülent GÖĞEBAKAN2, Recep BAYRAKTAR2,Serdar ÖZTUZCU2, Hasan BAYRAM1,2 Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi 1 Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı, 2 Hücre Kültürü Laboratuvarı Türk Toraks Derneği 13. Yıllık Kongresi 2010

2. Giriş-1 • Artmış 10µm partiküler madde (PM10) ile solunumsal ve kalp hastalıklarına bağlı mortalite ve morbidite arasında yakın bir ilişki mevcut - McConnell R et al,AJRCCM 2003, - Pope CA et al, NEJM 2004 • Dizel egzoz partikülleri (DEP) hava yolu epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımını arttırırlar - Bayram H et al, AJRCMB 1998

3. Giriş-2 • DEP, serumsuz ortamda,oksidatif stresi artırmak, p21CIP1/WAF1 ekspresyonunu baskılamak, JNK ve NF-B yolaklarını uyarmak suretiyle A549 hücre proliferasyonunu artırabilir ve apopitozisi baskılayabilir. -Bayram H et al, Eur Respir J 2006

4. Giriş-3 • Astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi hava yolu inflamasyonu ile seyreden hastalıklarda c-Jun N-Terminal Kinaz (JNK), ‘Extra Cellular Regulated Kinase’ (ERK) ve Nuclear Factor (NF)-kB yolakları aktive olmaktadır. - Hoshino S et al, Biochemical and Biophysical Research Com. 2005 - Rahman I. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2003 - Lee YC at al, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008 - Edwards MR et al, Pharmacology & Therapeutics 2009.

5. Amaç • İn vitro hücre kültürü ortamında serum kullanarak inflame hava yolu modeli oluşturmak • Sürece oksidatif stresin etkisini ve c-jun N Terminal Kinase (JNK), Extra Regulated Kinase (ERK) ve Nuclear Factor (NF)-κB sinyal ileti yolaklarının rolünü araştırmak • DEP’nin bu koşullarda hava yolu epitel hücre canlılığı, apoptozi ile p21, p27 ve p53 ekspresyonuna etkisini araştırmak

6. Metodlar-1 • A549, BEAS-2B ve primer bronş epitel hücre kültürleri %0, 1, 3.3 ve 10 FCS varlığında 48 saat süreyle, N-asetil sistein (NAC), JNK inhibitörü (SP600125), ERK inhibitörü (PD 98059) ve NF-B inhibitörü (SN50) varlığında veya yokluğunda 0, 50, 100, 200, 400 ve 1000 g/ml DEP 'ne maruz bırakıldı • Hücre canlılığı MTT boyama yöntemi ile değerlendirildi

7. Metodlar-2 • Hücreler Annexin V-PE (turuncu floresan) ve 7AAD (kırmızı floresan) içeren kit ile aynı anda boyanarak apoptotik hücrelerle nekrotik hücreler akım sitometriile değerlendirildi. • p21, p27 ve p53 ekspresyonu ‘real time’ PCR yöntemi ile değerlendirildi.

8. DEP’nin Farklı Serum Konsantrasyonlarında A549 Hücre Canlılığına Etkisi *p<0.05,**p<0.001, ***p<0.0001 - 0µg/ml DEP

9. DEP’nin Farklı Serum Konsantrasyonlarında BEAS-2B Hücre Canlılığına Etkisi *p<0.05,**p<0.001, ***p<0.0001 - 0µg/ml DEP

10. DEP’nin Farklı Serum Konsantrasyonlarında Primer Bronş Epitel Hücre Canlılığına Etkisi *p<0.05,**p<0.001, ***p<0.0001 - 0µg/ml DEP

11. NAC ve JNK İnhibitörlerinin Serumun (%3.3) ve DEP(200µg/ml)’in Modifiye Ettiği A549 Hücre Canlılığına Etkisi JNKinh. NAC ***p<0.0001- 0µg/ml DEP ♦p<0.0001- 200µg/ml DEP Φp<0.01- 200µg/ml DEP + DMSO

12. ERK ve NF-κB İnhibitörlerinin Serumun (%3.3) DEP(200µg/ml)’in Modifiye Ettiği A549 Hücre Canlılığına Etkisi ERKinh. NF-kBinh. ***p<0.0001- 0µg/ml DEP

13. DEP’nin (200 μg/ml) %3.3’lük FCS Ortamında A549 Hücre Apoptozisine Etkisi

14. p53 DEP’nin %3.3’lük FCS Ortamında A549 Hüc.de p53, p21, p27 mRNA Ekspresyonuna Etkisi p27 p21

15. Özet-1 • DEP serumsuz ortamda hücre canlılığını artırırken, serumlu ortamda (%3.3), A549 hücre canlılığını baskılamaktadır • Oksidatif stres ve oksidatif strese duyarlı yolaklar (JNK ve ERK) ile NF-κB yolağının bu süreçteki rolü sınırlı görünmektedir • NAC ile JNK, ERK ve NF-κB inhibitörleri serumun olduğu ortamda A549 hücre canlılığını baskılamaktadır. • DEP serumlu ortamda A549 hücre apoptozis/nekrozunu etkilememektedir. • DEP %3.3’lük serum ortamında A549 hücrelerinden p53 ekspresyonunu artırmaktadır. • DEP düşük konsantrasyonlarda hem serumsuz hem de serumlu ortamda BEAS-2B hücre canlılığını arttırmakta ancak yüksek konsantrasyonlarda baskılamaktadır • DEP hem serumsuz hem de serumlu ortamda primer bronş epitel hücre canlılığını baskılamaktadır

16. Özet-2 • BEAS-2B hücrelerinde %0-3.3 FCS ortamında düşük DEP konsantrasyonları hücre canlılığını artırırken, yüksek konsantrasyonlar hücre canlılığını baskıladı. %10 FCS kullanıldığında ise yüksek DEP dozları hücre canlılığını baskıladı. • Primer bronş epitel hücrelerinde ise yüksek DEP konsantrasyonları % 0-10 FCS ortamında hücre canlılığını baskıladı.

17. Sonuç • Hava yollarında inflamasyonun eşlik ettiği KOAH ve astım gibi hastalıklarda görülen JNK, ERK ve NF-kB aktivasyonundan hava yolu mukozasına olan serum sızıntısı kısmen de olsa etkili olabilir. • Bu koşullarda DEP gibi kirleticilerin hücre düzeyindeki toksik etkileri artabilir. • Hava yollarının farklı kökendeki epitel hücreleri DEP’nin toksik etkilerinden değişen derecelerde etkilenebilirler. • Altta yatan mekanizmaların daha fazla araştırılması gerekmektedir.

18. Bu çalışma Gaziantep Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Teşekkürler…