Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Como a Filogenia pode nos ajudar!!!! Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho imvgcmello@unifesp.br

Considerações importantes • Regiões amplificadas sãs as regiões adequadas á pergunda em questão? • O PCR esta adequado para a realização de uma reação de sequenciamento? • Qualidade da sequência genômica • - Ambiguidades (polimorfismos) • - “N” nas sequências • Qualidade do alinhamento • - “gaps”no alinhamento • Melhor trabalhar com nucleotideos ou aminoácidos (a região é codificante?)? • Análise filogenética • - Método • - modelo • Que sequencias controle usar nas análises !!!!! Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Sempre teremos uma árvore filogenética Mas o resultado é consistente????? Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

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objetivos Verificar a transmissão do HIV por transfusão de sangue utilizando análise filogenética de sequencias de DNA do HIV do doador e receptor de sangue de um banco de sangue brasileiro Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos O que levou a estes estudo!!! • Em 2009 surgiu a suspeita que uma paciente que havia recebido componentes de sangue numa cirurgia de retirada de cisto de ovário, tivesse recebido algum desses componentes contaminados com HIV • A suspeita surgiu quando a paciente reportou, aproximadamente uma semana após a cirurgia, febre, linfoadenopatias e alterações hematológicas • Nesta ocasião iniciou-se então a investigação retrospectiva do doador e do seu parceiro...  Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos • Testes realizados • - EIA = enzima imunoensaio • - WB = wetern Blot • - CHHia =Quimioluminescência (prisma) • - RT PCR = Real time PCR • Nested PCR • - envelope = ED5/ED12 e ED31/ED33 • - polimerase = DP10/MMRT6 e DP16/MMRT5 • Reação de sequenciamento • Análises filogenéticas • - Distância (Mega4)/ tamura Nei / 1000 réplicas de bootstrap • - ML(PHY ML)/ Kimura / 1000 réplicas de bootstrap Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

conclusão Foi observada alta similaridade entre as sequencias genomicas do doador e receptor (Menos de 1% de divergência entre as sequencia nucleotideas) Foi observada maior similaridade entre as sequencias do região pol quando comparado com as sequencias do envelope. Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

objetivos Avaliar a transmissão do HIV entre casais numa: coorte de casais HIV positivos (concordantes), residentes em Dakar no Senegal Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos De maio de 2005 até fevereiro de 2009, pacientes das consultas do ambulatório de HIV do Centro Hospitalar Universitário Fann, em Dakar no Senegal foram convidados a participar do estudo com o seu Parceiro Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados • 34 casais – as sequencias agruparam com bootstrap acima de 80% e distância abaixo do cut off (0,04) • Estas sequências foram consideradas geneticamente relacionadas • 6 casais – as sequencias agruparam mas com bootstrap abaixo de 80% e distância abaixo ou acima do cut off • Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas • 6 casais – as sequências não agruparam e a distância acima do cut off • Estas sequências foram consideradas geneticamente indeterminadas Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

conclusão • A maioria dos casais (concordantes) HIV positivos em Dakar no Senegal mostrou sequencias geneticamente relacionadas • Dados epidemiológicos indicam o marido como o provável caso indice, estes dados enfatizam o risco de mulheres casadas em contrair HIV como resultado de relações sexuais ocasionais de seus maridos • Compreender as origens e dinâmicas da infecção HIV-1 em casais na África será crucial para o planejamento futuro e sucesso de programas de prevenção do HIV Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

objetivos • Acompanhar o padrão de evolução de HIV-1 na Ásia durante o período de 17 anos • A actividade biológica e patogenicidade de um dos mais prevalentes subtipos do HIV (subtipo B) na Ásia foi determinada com base nas sequências de HIV-1 do período de 1990 -2007 disponíveis no banco de dados de Los Alamos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos • Os data sets foram divididos em 4 grupos • Grupo I: 1990 – 1994 • Grupo II: 1995 – 1999 • Gupo III: 2000 – 2004 • Grupo IV: 2005 – 2007 • Foram realizados dois tipos de análises da proteina do envelope e da alça V3 das sequencias retiradas do banco de Los Alamos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos • Análises filogenéticas baseadas na proteína do envelope • Predição de sitios de glicosilação na proteína do envelope • Alinhamento do dominio V3 • Análise do “Motif” GPGX • Determinação de regiões conservadas da região V3 Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados • Os clusters B, C, D e E apresentaram divergência e taxas de mutação altas • Os clusters A e F exibem forte seleção e permanecem menos divergentes durante estes período • Foi observado um aumento de heterogeneidade nas sequencias de envelope na população infectada durante este periodo Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados 60% dos sitios da V3 permanecem conservados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

conclusão • A patogenicidade e infectividade do subtipo B do HIV-1 está aumentada e mostrou uma rápida evolução e um mecanismo de modulação • Os dados analisados também fornecem informações úteis sobre a vigilância da infecção do HIV-1 na Ásia e destaca o padrão evolutivo de populações de vírus que possam estar sob pressões variadas de seleção durante os diferentes períodos de tempo Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

objetivos • Analisar as relações filogenéticas de diferentes regiões do genoma do VHC de amostras de casais portadores crônicos • Comparar as sequências genômicas dos casais portadores de VHC com sequências de portadores crônicos, não relacionados, atendidos no mesmo ambulatório • Avaliar o grau de similaridade entre as sequências genômicas do VHC dos casais e dos portadores não relacionados Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Excluído das análises de NS3 Material & Métodos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos Tabela 1 - Características dos pacientes (casais) selecionados (dados obtidos de prontuário) S/Inf* = Sem informação ** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Material & Métodos Tabela 2 – Características pacientes controle (dados obtidos de prontuário) S/Inf* = Sem informação ** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Tabela 2 - Características dos pacientes controle (dados obtidos de prontuário) (continuação) S/Inf* = Sem informação ** = mais de 2 parceiros no período de 6 meses Material & Métodos Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

B A D C Resultados Análise do sinál filogenético NS5B 199nt (77 seq) NS5B 344nt (77 seq) NS3/NS5B 960nt (72 seq) NS3 619nt (72 seq) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados Variabilidade nucleotidica • Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos casais • Região NS5B  entre 78,2% e 99,1% (média de 95,45%) • Região NS3  entre 94,7% e 99,2% (média de 97,24%) • Similaridade entre as sequências de nucleotídeos dos controles locais e sequências do Genbank • Região NS5B  entre 53,9% e 98% (média de 72,9%) • Região NS3  entre 61% e 98,2% (média de 74,8%) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

A NS3/NS5B MV TBR TrN+I+G B C (Bootstrap=1000 réplicas) Resultados Análise filigenética das regiões NS3/NS5B A B C Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

A A NS3/NS5B MV TBR B TrN+I+G (Bootstrap = réplicas) C B C Resultados Análise filigenética das regiões NS3/NS5B (Com controles) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

A B C A B NS5B MV TBR TrNef+I+G C (Bootstrap = 1000 réplicas) Resultados Análise filigenética da regiãoNS5B (Com controles) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados Resumo das análises das árvores filogenéticas (sem controle) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Resultados Resumo das análises das árvores filogenéticas (com controle) Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

conclusão • A escolha da região genômica e do método de análise filogenética a ser utilizado são importantes para a precisão dos resultados • Os dados de prontuário juntamente com as análises moleculares indicam que a origem dos vírus dos casais 8, 7, 6, 3 e 4 seja a mesma, dando suporte à hipótese de transmissão intrafamiliar Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

conclusão • A inclusão dos controles nas análises mostrou-se relevante para a confirmação dos resultados • Dados como similaridade de sequências não são suficientes para inferir mesma fonte de transmissão Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

Obrigada Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho

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