RETARD MENTAL & CGH Array

1. RETARD MENTAL & CGH Array D. Le Tessier, I. Jégoux, A. Ménard Laboratoire de cytogénétique Hôpital Cochin. Paris

2. LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE • Selon l’Organisation Mondiale de la Santé : • « Le retard mental est un arrêt du développement mental ou un développement mental incomplet, caractérisé par une insuffisance des facultés et du niveau global d'intelligence, notamment des fonctions cognitives, du langage, de la motricité et des performances sociales. Des capacités intellectuelles réduites sont le trait dominant de ce trouble, mais on ne pose le diagnostic que si elles s'accompagnent d'une moindre capacité d'adaptation aux exigences quotidiennes de l'environnement social » • L'Association Américaine de Psychiatrie ajoute à cette définition que l'âge de survenue de la déficience doit être inférieur à 18 ans (Chelly 2000)

3. EVALUATION DE LA DEFICIENCE INTELLECTUELLE

4. DI légère • Repérée lors des premières difficultés scolaires. • Acquisition des aptitudes pratiques. Lecture et notion d’arithmétique (éducation spécialisée). • Adultes capables de travailler, d’avoir des relations sociales. • Intégration dans la société. • DI modérée • Langage acquis. • Premiers apprentissages scolaires (lecture et calcul) peuvent être assimilés mais de façon limitée. • Autonomie restreinte. Besoin d’accompagnement réel. • DI grave ou profonde • Association d’autres handicaps, visuels, auditifs ou moteurs. • Pas de langage ou de façon très atténuée. • Accompagnement dans des institutions spécialisées. • Pas d’accès au monde du travail.

5. ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES: ENVIRONNEMENT ( 20% des DI) • Infections maternelles périnatales: rubéole, toxoplasmose, syphilis, cytomégalovirus. • RCIU:corrélation entre le faible poids de naissance et l’augmentation de la prévalence de DI. • Alcoolisme et autres substances toxiques : prévalence du FAS: 1/1000 dans le monde. 1/300 à 1/800 (selon études) en France. métaux lourds, rayons X, médicaments, drogues. • Complications vaccinales: devenues rares • Niveau socio-économique : prévalence dans les pays pauvres plus élevée que dans les pays riches.

6. ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:GENETIQUE I (40% des DI) • Anomalies chromosomiques entraînant la modification de l’expression de gènes localisés dans la région chromosomique remaniée. • Aneuploïdies • Trisomie 21 … • Anomalies de structure déséquilibrées • Inversions ,translocation, anneaux… • Syndromes microdélétionnels (3% des DI à caryotype normal) • Microduplications • Anomalies des régions subtélomériques (5% des DI idiopathiques). • Certains de ces syndromes s’associent à un phénotype identifiable et sont détectables en cytogénétique classique, par FISH ou par MLPA

7. µdel 70% des cas de PWS 30% avec DUP µdel 70% des cas de AS 5% avec DUP

8. ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:GENETIQUE II • Mutations affectant un seul gène induisant les causes monogéniques de DI et dont le gène déficient est impliqué dans le développement des fonctions cognitives. Pathologies liée à l’X • Syndrome de l’X fragile (localisation Xq27.3. Gène FMR1) • Le syndrome de Rett (localisation en Xq28. Gène MECP2) …….. ADID ( Autosomic Dominant Intellectual Disability) • Sclérose tubéreuse de Bourneville (localisation 9q34.13. Gène TSC1. Localisation 16p13.3. Gène TSC2) • Neurofibromatose (localisation 17q11.2. Gène NF1) ARID ( Autosomic Recessive Intellectual Disability)

9. Vous ne voyez rien car tellement de gènes

10. ETIOLOGIES DES DEFICIENCES INTELLECTUELLES:GENETIQUE III • Dérégulation du mécanisme d’empreinte de gènes spécifiques ou de régions du génome. (DUP et mutation du centre d’empreinte) • Syndrome de Prader-Willi (25-30% des cas de PWS) • Syndrome d’Angelman (10%) • Silver Russel ( 7% des cas. 2 copies du chromosome 7 mat) • Beckwith-Wiedemann (gène IGF2) en 11p15

11. LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE LE CARYOTYPE: résolution 5-10Mb LA FISH: choix des sondes (ciblée)

12. LES TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE La M FISH: information sur les remaniements CGH sur métaphases: résolution 3-10Mb ADNpatient ADN témoin Métaphase normale

13. Microarray : support en verre sur lequel sont déposées ou synthétisées in situ des molécules= Puce à adn ou ACPA (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN) Synthèse in situ (Oligomères de 20 à 60 nucléotides) Dépôt (= Spotting) de produits de PCR/ BAC/PAC Photolithographie (Affy;Nimblegen) Jet d’encre (Agilent) >100000 spots/cm² 18.000 spots/cm² 2000 spots/cm² 2 types de technologies

14. Extraction des données: logiciel Duplication vert>rouge CGX-12 CGX-3 CGX-6 Normal vert =rouge Délétion vert <rouge ADN patient Cy3 ADN Témoin Cy5 4 H ou plus Combinaison Hybridation 20 à 40 h 1 spot= 1 séquence ADN en plusieurs copies Lavages et scan 30 min

15. AVANTAGES ET LIMITES DE LA CGH Array • Avantages • Explore sur le génome les déséquilibres chromosomiques. • 1000 fois plus résolutive que le caryotype haute résolution. • Localisation précise des déséquilibres. • Identification des marqueurs surnuméraires. • Puces « à façon » disponibles. • Limites • Ne détecte que les anomalies chromosomiques déséquilibrées. • Interprétation des résultats délicate. • Ne donne pas d’information sur le mécanisme d’un réarrangement déséquilibré. • Problème des mosaïques.

16. LA CGH ARRAY VERSION NIMBLEGEN® EXPÉRIENCE DE COCHIN

17. CGX-12 LA PUCE NIMBLEGEN® CGX Cytogenetics Array Puce utilisée: 12x135K 1 puce= 12 patients 135.000 sondes: 1 sonde tous les 100Kb en moyenne 1 déséquilibre: 5 sondes consécutives

18. Qualité de l’ ADN RAPPELS TECHNIQUES ET THÉORIQUES Extraction ADN 260/280 >1,8 260/230 ≥ 1,9 Migration +++

19. STRATEGIE TRIO (J.Vermeesch) 24 marquages 12 Hybridations 12 résultats CY 3Cy5 Patient 1 / Patient 2 Patient 2 / Patient 3 Patient 3 / Patient 1 Patient 1 Cy3/ Patient 2 Cy5 Patient 2 Cy3/ Patient 3 Cy5 Patient 3 Cy3/ Patient 1 Cy5

20. SCHEMA DE LA LAME : ORGANISATION

21. GENOGLYPHIX® Chromosome15( dup + del)

22. GENOGLYPHIX® délétion Amplification Clones maison Gènes de la région Clones UCSC Variants

23. Amplification de la région 15q24 de 2.8Mb. Patient Cy5 Patient Cy3 Variants

24. PATIENT 1: CO. S Petite fille née le 23/12/2002 • Microcéphalie à -4DS, atrophie ponto-cérébelleuse . Spasticité modérée. Nystagmus. • Marche seule n’est pas acquise. Taille à -3DS. Pas de régression des acquisitions . Langage limité à des sons. • Caryotype standard normal résolution 400-500 bandes.

25. RESULTAT DE LA PUCE Patient Cy3 Nuage de points Miroir Patient Cy5

26. Délétion de 359kb sur le bras court du chromosome X en Xp11.4 emportant une partie du gène CASK Taille de la délétion Patient Cy3 Nuage de points Miroir Patient Cy5

27. ETUDE DU PATIENT FISH PCRq 2 copies QR=1 1 copie QR=0.5 1 copie QR=0.45

28. CARTE UCSC du gène CASK Choix du BAC car délétion s’étend de 41,403,101 à 41,762,580

29. ETUDE DES PARENTS FISH PCRq 2 copies QR=1 2 copies Q R=0.98 1 copie QR=0.45 1 copie QR=0.45

30. Interprétation - conseil génétique • La puce oligonucléotidique utilisée a mis en évidence une délétion de 359Kb en Xp11.4 (41,403,101 à 41,762,580) (Hg18). Cette délétion a été confirmée en hybridation in situ avec le BAC RP3-421H1. L'étude des parents de S. a permis de montrer que cette délétion était de novo. Cette délétion emporte une partie du gène CASK impliqué dans le développement cérébral. • La symptomatologie des cas de mutations et de délétions de ce gène rapportés dans la littérature : compatible avec le tableau clinique de la patiente conseil génétique adapté.

31. PATIENT 2: CA.R • Garçon né le 30.04.2001 • Position assise vers 6 mois. Marche à 27 mois. Pas de propreté acquise. • Evolution par paliers sans réelle régression. • Absence de langage, nombreuses stéréotypies. • Caryotype standard normal. Résolution 400 bandes.

32. Duplication interstitielle de 4.2Mb sur le bras court du chromosome 16 en 16p13.1 Patient Cy3 Patient Cy5 Variants

33. Carte Ensembl! du gène MYH11 Gène MYH11 Choix du bac : duplication s’étend de 14,654,314-18,423,952……

34. PCR quantitative du patient et de la famille

35. FISH patient et famille Patient Maman Soeur Frère

36. Interprétation et conseil génétique • La puce oligonucléotidique montre une duplication interstitielle 16p13.11-p12.3 d’une taille de 4.2 Mb. Confirmée par une technique de PCRq. Copies de 3 loci testés dans le gène MYH11 • Cette duplication est d'origine maternelle. • Gène MYH11 intervient dans le transcrit de la myosine du muscle lisse. • L’hybridation In Situ avec le Bac RP11-489O1 permet d’éliminer l’hypothèse d’une insertion interchromosomique comme mécanisme de cette duplication et confirme la duplication sur noyaux interphasiques • La microdélétion de cette région est connue. Étude des parents et de la fratrie montre que cette duplication est héritée . Du fait de la pénétrance variable de la duplication de cette région, on ne peut exclure sa responsabilité dans la symptomatologie du patient.

37. LES CNVs (Copie Number Variation) • Meilleure résolution des techniques conduit à identifier de nombreux remaniements de taille variable; les CNVs ou variants de structure . • Certains variants n’ont pas de conséquence phénotypique alors que d’autres sont pathogènes. • Segments d’ADN de taille supérieure à 1Kb présents en nombre de copies variables. • Sont à l’origine de difficultés d’interprétation des résultats de CGH array.

38. INTERPRETATION DES CNVs

39. Activité 2010 • 226 CGH array • 133 rendues normales • 46 avec anomalies • (47 non rendues car attente des parents) • Activité 2011 • 352 CGH Array • 65 remaniements détectés • Soit un taux d’anomalies de 18,5%

40. BIENVENUE A GATTACA